Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de las celdas alimentadoras AC-6
Nota: La línea celular estromal AC-6.21 (AC-6 en resumen) (proporcionada por I. Weissman, Universidad de Stanford) debe mantenerse en RPMI suplementado con un 15% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor. Para servir como células alimentadoras, las células AC-6 se irradian con γ con 3.000 rad (30Gy) un día antes del cocultivo para evitar su proliferación. Tenga en cuenta que las células AC-6 tienden a perder su capacidad de soporte de diferenciación si se dejan abarrotadas durante el mantenimiento, o si su número de paso es superior a 20.
- Lave las células AC-6 una vez con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco y elimine el DPBS por aspiración. Tratar las células AC-6 con 0,8 ml de solución de tripsina (0,05 % de tripsina y 0,5 mM de EDTA en DPBS) durante 3-5 min a 37oC, 5% de CO2 y luego detener la reacción diluyéndola con 10 volúmenes de medio de cultivo para hacer una suspensión unicelular.
- Siembre las células AC-6 a 5,9x104 células/pocillo en placas de 12 pocillos e incube a 37oC, 5% de CO2 O/N.
nota: La densidad de las celdas AC-6 es muy importante ya que una menor densidad favorecerá la generación de cDC. La siembra a una densidad de 5,9x104 células/pocillo permitirá que el AC-6 alcance la confluencia al día siguiente, lo cual es óptimo para la derivación de pDCs a partir de CLPs.
- Irradie las células AC-6 a 3.000 rad (30 Gy) utilizando un irradiador de γ.
Nota: La dosis utilizada para irradiar AC-6 está optimizada para evitar que las células proliferen y, al mismo tiempo, mantenerlas viables el tiempo suficiente para proporcionar las citocinas y el contacto célula-célula necesarios para la diferenciación de las CD de las CLP.
- Aspire el medio y reemplácelo con 1 ml de RPMI completo (RPMI con 10% de FBS inactivado por calor, 50 μg/ml de gentamicina y 50 μM de β-mercaptoetanol).
>2. Aislar células BM de ratones
- Ratones de sacrificio por asfixia con CO2 y luxación cervical. Coloque los ratones en una bandeja de disección y esterilícelos con etanol al 70%. Realice una incisión en la parte media del abdomen y retire la piel de la parte distal del ratón, incluida la piel que cubre las extremidades inferiores.
- Disecciona ratones en una capucha semiestéril. Para liberar el fémur y las tibias, corte el fémur por encima y las tibias por debajo de la articulación de la rodilla. Separe los músculos de los huesos con unas tijeras y coloque los huesos en una placa de Petri de 6 cm que contenga 5 ml de RPMI completo.
- Pase a una campana de cultivo estéril. Llene una jeringa de 3 ml conectada a una aguja de 27G con RPMI completo. Corta ambos extremos de los huesos con unas tijeras e inserta la aguja 27G para extraer la médula de los huesos inyectando suavemente RPMI completo una vez desde cada extremo.
- Prepare una suspensión de una sola célula pipeteando suavemente las células hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces en la placa de cultivo con la jeringa sin la aguja.
- Centrifugar las células durante 5 min a 500 x g y decantar el sobrenadante.
- Lisar los glóbulos rojos con 1 ml de tampón ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) incubando durante 1 min y detener la reacción diluyendo con 10 volúmenes de RPMI completo. Deje reposar las células durante 5 minutos para que la gravedad elimine los grupos de células muertas y los restos de tejido.
nota: No permanezca de pie durante más de 5 minutos, ya que esto resultará en la pérdida de células debido a la sedimentación de células viables.
- Decantar lentamente el sobrenadante que contiene células en un nuevo tubo, dejando los residuos en el tubo original.
- Centrifugar durante 5 min a 500 x g para granular las células, luego retire y deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el total de células BM (normalmente se obtienen 4-6 x 107 células BM de un ratón) en 100 μl de tampón FACS (1x PBS+ 2% FBS+ 1mM EDTA).
>3. Análisis FACS y clasificación de CLPs
- Añadir anti-CD16/32 (hibridoma, clon supernant 2.4G2, 50 μl/reacción o 1-2 μg/reacción) en las células del tampón FACS (paso 2.9) durante 1-2 min para bloquear los receptores Fc.
nota: El anti-CD16/32 también se denomina bloqueo Fc, que se añade para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos a las células que expresan receptores Fc, incluidos los granulocitos, los monocitos y los linfocitos B.
- Tiña simultáneamente las células con los siguientes anticuerpos marcados con colorante fluorescente (para 4x107 células) durante 15 minutos en hielo, evitando la luz ambiental. Anticuerpos: marcadores de linaje conjugados con PE (0,2 μg cada uno), incluidos anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6). 7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1/70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti-Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119) y anti-MHC-II (NIMR-4), 0.2 μg anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 μg anti-Sca-1-FITC (D7), 0.4 μg anti-M-CSFR-APC (AFS98) y 0.2 μg anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
- Lavar las células con 3 ml de tampón FACS y centrifugar durante 5 min a 500 x g.
- Vuelva a suspender las células en un tampón FACS de 300 μl y filtre las células a través de un filtro de células de 40 μM.
- Lave el tubo con 100 μl adicionales de tampón FACS para recuperar las células restantes y filtrarlas en un tubo de clasificación FACS estéril utilizando el mismo filtro de células.
- Realice el análisis de citometría de flujo inmediatamente después de la tinción utilizando filtros y voltajes adecuados para la detección de señales. Utilice un láser de 488 nm para detectar los anticuerpos marcados con FITC, PerCP-Cy5.5, un láser de 561 nm para detectar los anticuerpos marcados con PE y PE-Cy7 y un láser de 633 nm para detectar el anticuerpo marcado con APC.
- Clasifique los CLP de acuerdo con los siguientes marcadores: lin-c-kit intSca-1,intM-CSFR-IL-7Rα+ (como se tiñe en el paso 3.2) utilizando un clasificador de células. Recoja las células clasificadas en un tubo de 15 ml que contenga 8 ml de RPMI completo como cojín.
- Registre el número absoluto de celdas ordenadas tal como se muestra en el clasificador de celdas al final de la ejecución. Normalmente, se pueden obtener 5x104 CLP a partir del BM de un ratón.
>4. CLPs de cocultura y AC-6
- Centrifugar las células clasificadas del paso 3.7 durante 10 minutos a 500 x g, retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de células con suficiente RPMI completo para obtener una densidad de células de alrededor de 5x104 células/ml. Siembre 500 células/pocillo en la placa de 12 pocillos que contiene las células alimentadoras preparada en el paso 1.4.
- Añadir 100 ng/ml de FL (hu-Flt3L-Ig generado internamente utilizando un sistema de expresión proporcionado por M. Manz, Hospital Universitario de Zúrich, Suiza) e incubar a 37oC, 5% de CO2 con monitorización visual periódica del desarrollo de DC bajo un microscopio.
nota: La FL recombinante humana o de ratón disponible en el mercado puede utilizarse como sustituto de hu-Flt3L-Ig para apoyar el desarrollo de la DC.
- Recoja las células en el sobrenadante el día 12 y lave los pocillos una vez con 0,5 ml de medio RPMI completo combinando los sobrenadantes resultantes. Añadir 0,5 ml de medio fresco y raspar las células adheridas con un raspador de células.
- Combine el medio que contiene la célula de ambas partes y centrifugue durante 5 minutos a 500 x g.
- Decantar el sobrenadante y resuspender las células en tampón FACS de 50 μl. Añadir 50 μl de sobrenadante de hibridoma anti-CD16/32 e incubar durante 1-2 min para bloquear los receptores Fc.
- Enumere y tiña todas las células con los siguientes anticuerpos (0,05 μg cada uno): anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC y anti-B220-PE.
- Lave y centrifugue las células como se describe en el paso 3.3.
- Vuelva a suspender las células en un tampón FACS de 100 μl, conecte CD11c+ y analice las cDC (CD11c+CD11b+B220-) y las pDC (CD11c+CD11b-B220+).