Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
- Preparación del reactivo
- Preparar PBS/EDTA: solución salina tamponada con fosfato (PBS) y complementar con 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Esterilice esta solución por filtración a través de un filtro de 0,2 μm. NOTA: almacenar PBS/EDTA a 4 °C y calentar a temperatura ambiente antes de su uso.
- Preparar tampón de tinción: suplemento de solución salina (PBS) tamponada con fosfato con suero fetal bovino (FBS) al 2%, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinenetanosulfónico (HEPES) y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Esterilice esta solución por filtración a través de un filtro de 0,2 μm.
- Recoger sangre del cono de sangre
nota: El cono de sangre contiene componentes de glóbulos blancos recolectados después de la plaquetféresis del hospital. Si la sangre se recolecta en tubos de heparina o EDTA, diluya la sangre con PBS en una proporción de 1:1 y continúe con el paso 1.3; si se recibe un pelaje buffy, diluya el pelaje buffy con PBS en una proporción de 1:2 y proceda al paso 1.3.
- Corta los dos extremos del cono para permitir que la sangre fluya hacia un tubo de 50 ml.
Ten en cuenta que el cono suele contener 10 ml de sangre.
- Utilice una jeringa de punta roma que contenga 30 ml de PBS/EDTA para lavar el cono y recogerlo en un tubo de 50 ml.
- Diluir la sangre con PBS/EDTA hasta un volumen final de 80 ml.
- Aislamiento de PBMC por centrifugación por densidad
- Alícuota de 15 ml de Ficoll cada uno a 4 tubos frescos de 50 ml.
- Utilice una pipeta serológica de 25 ml para añadir 20 ml de sangre diluida sobre la capa de Ficoll. Tenga en cuenta que debe sujetar el tubo de 50 ml en un ángulo de 45 y tenga cuidado de no perturbar la interfase.
- Centrifugar los tubos a 805 x g sin frenos durante 30 min, 20 °C.
- Retire la capa de plasma y recoja el anillo de PBMC que se encuentra justo debajo de la capa de plasma con una pipeta Pasteur. Combine cuatro tubos de PBMC en dos tubos de 50 ml. Tenga en cuenta que debe evitar recopilar la capa transparente debajo de los PBMC.
- Añadir PBS/EDTA hasta un volumen final de 50 ml por tubo de PBMC y centrifugar a 548 x g con freno durante 10 min, 20 °C.
- Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cada tubo con 25 ml de tampón de tinción y combínelo en un tubo de 50 ml.
- Centrífuga a 367 x g con frenos durante 5 min, 4 °C.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet con 10 ml de tampón de tinción.
>2. Enriquecimiento de monocitos por separación magnética
- Determinar el número de celda
- Tome 20 μl de suspensión de células PBMC y mézclelo con 20 μl de azul de tripán para contar el número de células vivas con un citómetro.
- Suspensión de la célula centrífuga a 367 x g con frenos durante 10 min, 4 °C.
- Aspire completamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular a una concentración de 10a 7 células por 80 μl de tampón de tinción.
- Etiquetado magnético
- Añadir 20 μl de microperlas CD14 por cada 107 células, mezclar bien e incubar durante 15 min a 2 - 8 °C.
- Lavar las células añadiendo 1 ml de tampón de tinción por cada 107 células y centrifugar a 367 x g con frenos durante 10 min, 4 °C.
- Aspirar completamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en una concentración de 10a 7 células por 50 μl de tampón de tinción.
- Separación magnética
- Utilice una columna de tamaño mediano para un máximo de 2 x 108 celdas en total.
nota: Elija una columna y un separador apropiados de acuerdo con el número total de celdas y el número de celdas CD14+ recomendados en la hoja de datos.
- Coloque la columna en el campo magnético de un separador adecuado y prepare la columna enjuagándola con 500 μl de tampón de tinción.
- Pipetee la suspensión de células en la columna y recoja las células no marcadas que pasan a través de la columna con un tubo de 15 ml.
- Sustituya un nuevo tubo de 15 ml debajo de la columna y lave la columna 3 veces con 500 μl de tampón de tinción. Asegúrese de que el depósito de la columna esté vacío antes de agregar un nuevo tampón de tinción entre lavados.
- Retire la columna del separador y colóquela en un tubo nuevo de 15 ml.
- Pipetear 1 ml de tampón de tinción en la columna. Enjuague inmediatamente las celdas marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo (provisto en el kit) en la columna.
- Repita los pasos 2.3.2 a 2.3.6 utilizando la fracción eluida en una nueva columna para aumentar la pureza de las células CD14+. Tenga en cuenta que las perlas se liberarán de las células automáticamente en cultivo durante el paso 3.2.
>3. Diferenciación de células dendríticas a diferentes estados de activación
- Preparación del reactivo (el nivel de endotoxinas debe ser inferior a 0,1 UE/ml en todos los reactivos)
- Preparar el medio de cultivo celular: RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA) y 0,05 mM de 2-mercaptoetanol (2ME). Esterilice esta solución por filtración a través de un filtro de 0,2 μm.
- Preparar citocinas: reconstituir IL-4 y GM-CSF en agua de grado de cultivo celular a una concentración de 0,25 mg/ml respectivamente en condiciones asépticas. Aliquotar las citocinas en tubos de microcentrífuga de 200 μl y almacenarlas a -80 °C.
- Preparar el caldo de vitamina D3: reconstituir la vitamina D3 en agua apta para cultivos celulares a una concentración de 100 mM en condiciones asépticas. Aliquot la vitamina D3 en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y almacene a -20 °C.
- Preparación de la reserva de dexametasona: reconstituya la dexametasona en agua apta para cultivos celulares hasta una concentración de 10 mM en condiciones asépticas. Aliquot dexametasona en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar a -20 °C.
- Preparación de LPS: reconstituya los lipopolisacáridos (LPS) en agua de grado de cultivo celular a una concentración de 1 mg/ml en condiciones asépticas. Aliquot LPS en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y almacene a -20 °C.
- Generación de diferentes moDCs
- Siembre 4 juegos de monocitos CD14+ en una concentración de 0,3 - 0,5 x 106/ml de medio de cultivo celular suplementado con 200 ng/ml de GM-CSF y 200 ng/ml de IL-4 en placas de 6 pocillos. Tenga en cuenta que este es el día 0 y el volumen de medio en cada 6 pocillos es de 2 ml.
- Incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C con 5% de CO2.
- Retirar 850 μl de medio del cultivo en el día 4 y centrifugar a 300 x g durante 5 min, 4 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de medio de cultivo celular que contenga 2x (200 ng/ml de GM-CSF y 200 ng/ml de IL-4). Agregue esta mezcla de células nuevamente al cultivo. Tenga en cuenta que la concentración 2x añadida para GM-CSF e IL-4 se convertirá en 1x cuando se vuelva a añadir 1 ml de medio al cultivo.
- Agregue 1 μl de caldo de vitamina D3 y 1 μl de caldo de dexametasona por ml de medio a dos de los conjuntos el día 5 para generar moDC tolerogénicos. Tenga en cuenta que la concentración final de vitamina D3 es de 100 nM y la dexametasona es de 10 nM; la adición de GM-CSF e IL-4 no es necesaria el día 5.
- Añadir 200 ng/ml de GM-CSF y 200 ng/ml de IL-4 a todas las series el día 6.
- Agregue 1 μg/ml de LPS a uno de los conjuntos tratados solo con GM-CSF e IL-4 en el día 6 para generar moDCs maduros.
- Agregue 1 μg/ml de LPS a un conjunto de moDC tolerogénicos el día 6 para generar moDC tolerogénicos de LPS.
- Coseche los diferentes tipos de moDC el día 7 enjuagando la placa de cultivo con PBS, EDTA para citometría de flujo u otros estudios. Tenga en cuenta que solo se recolectan las células no adherentes. Tenga en cuenta que el rendimiento porcentual de los monocitos CD14+ para los moDC inmaduros, los moDC maduros, los moDC tolerogénicos y los DC tolerantes a LPS es de aproximadamente el 90%, 50%, 60% y 60% respectivamente, y varía entre los donantes de sangre y el lote de FBS.
