Aislamiento y purificación de células B de sangre periférica humana

Resumen

Fuente: Tzeng, S. J. El aislamiento, diferenciación y cuantificación de células B secretoras de anticuerpos humanos de la sangre: ELISpot como lectura funcional de la inmunidad humoral. J. Vis. Exp. (2016)

En este video, demostramos el aislamiento de células B de sangre periférica humana utilizando anticuerpos biotinilados específicos para células no B y microperlas magnéticas conjugadas con estreptavidina.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las pautas institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local

1. Aislamiento y purificación de células B de sangre periférica humana

1. Extraiga ~ 10 mL de sangre de la vena cubital mediana (en la fosa cubital anterior al codo) en un tubo de 15 mL que contenga K₂EDTA (1.5 a 2.0 mg/mL de sangre) e invierta inmediatamente el tubo varias veces para prevenir la formación de coágulos.
2. Añadir 35 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) esterilizado en autoclave (121 °C, 15 min) (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ y 1 mM EDTA; pH 7,4) al tubo que contiene la muestra de sangre fresca (≥ 3:1 vol/vol) e incubar a temperatura ambiente (RT) durante no más de 5 min.
   nota: La aparición de la transmisión de luz a través del tubo indica la finalización de la lisis de los glóbulos rojos.
3. Centrifugar a 600 x g a RT durante 5 min. Asegúrese de que el pellet sea de color blanco.
4. Vuelva a suspender el pellet con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato esterilizada en autoclave (PBS, 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM de_Na2HPO₄ y 1,47 mM de KH₂PO₄; pH 7,4) y centrifugar como en el paso 1.3.
5. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet con 10 mL de medio RPMI 1640 (suplementos: 10% de suero fetal de ternero, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B y 2 mM de L-glutamina) y luego coloque las células en una placa de cultivo de 10 cm (10 mL de sangre por placa). Coloque la placa en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ durante 30 min.
6. Agite suavemente la placa de cultivo unas cuantas veces y coloque el medio de cultivo (células de suspensión) en tubos cónicos de plástico de 15 ml. Deseche las células adherentes (principalmente macrófagos) en las placas de cultivo.
7. Centrifugar a 600 x g a RT durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
8. Vuelva a suspender el pellet con 1 mL de medio RPMI 1640. Cuente el número de células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
   nota: La viabilidad de los leucocitos aislados es normalmente superior al 90% por exclusión del azul de tripano.
9. Centrifugar como en el paso 1.7 y resuspender las células en ~ 200 μL de tampón PBS frío (0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de EDTA) a la concentración de 5 - 10 x 10⁶ células/mL.
10. Añadir 5 μL de cóctel Ab biotinilado anti-humano específico para células sanguíneas (para la selección negativa de células B) por cada 10⁶ células e incubar en hielo durante 30 min.
    nota: El cóctel anti-Ab humano debe incluir al menos Abs específicos para CD2 (o CD3), CD14 y CD16.
11. Agregue un volumen 10 veces superior de PBS estéril a las células, centrifugue a 600 x g durante 5 minutos y deseche el sobrenadante.
12. Agregue cantidades iguales de microperlas conjugadas con estreptavidina (5 μL por 10^{a 6} células) al pellet y mezcle bien.
13. Incubar en hielo durante 30 min en un tubo cónico de plástico de 15 mL.
14. Agregue 2 mL de tampón PBS en el tubo.
15. Coloque el tubo en un soporte magnético e incube a RT durante 8 min. Las microperlas marrones se adherirán gradualmente a la pared del tubo junto al imán.
16. Con el tubo restante en el soporte magnético, transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo estéril de 15 ml.
17. Repita los pasos 1.14 a 1.16 y combine los dos sobrenadantes que contienen las células B intactas. Deseche las microperlas.
18. Centrifugar a 600 x g a RT durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
19. Vuelva a suspender el pellet en el medio RPMI 1640 para experimentos posteriores.
    nota: Por lo general, se pueden aislar 1 - 5 x 10^{5 células} B con una pureza superior al 95% a partir de 10 mL de sangre periférica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BD Vacutainer K2E	BD Biociencias	367525	Tubo de 10 ml
Ficoll-Paque Plus	GE Cuidado de la Salud	17-1440-02	Libre de endotoxinas
Solución de azul de tripano al 0,5%	Industrias Biológicas	03-102-1B	teñir
Set de enriquecimiento de linfocitos B humanos IMag	BD Biociencias	558007	Reactivo
Microesferas magnéticas de estreptavidina	BD Biociencias	9000810	Reactivo
Tubos Falcon de 15 ml	Halcón BD	352196	Artículos de plástico
CD27 mAb biotinilado	Bioleyenda	302804	Clonar O323
Biotinilado anti-humano CD27	Bioleyenda	302804	Clonar O323
Biotinilado anti-humano CD27	eBiociencia	Teléfono 13-0279-80	Clonar O323