Clasificación de células basada en citometría de flujo para diferentes poblaciones de células B circulatorias

Abstract

Fuente: Tzeng, S. J. El aislamiento, la diferenciación y la cuantificación de las células B secretoras de anticuerpos humanos de la sangre: ELISpot como lectura funcional de la inmunidad humoral. J. Vis. Exp. (2016).

En este video, describimos un protocolo para la clasificación basada en citometría de flujo de subpoblaciones de células B vírgenes, células B de memoria y células plasmáticas de plasmablastos a partir de células B de sangre periférica humana. Las diferentes subpoblaciones de células B se pueden distinguir en función de la unión de anticuerpos basados en fluoróforos a los receptores CD19, CD27 y CD38 expresados en las superficies de las células B, seguida de la clasificación de las células.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Clasificación de células para la recolección de células B vírgenes, células B de memoria y plasmablastos/células plasmáticas (PB/PC)

1. Usando células B de sangre periférica humana purificadas, determine el número de células usando un hemocitómetro o un contador automático de células.
2. Vuelva a suspender las células en un tampón PBS frío a una concentración de 10⁷ por ml en un tubo de poliestireno de 5 ml.
3. Añadir 1 - 2 μg de IgG humana por cada 10⁶ células e incubar en hielo durante 10 min para el bloque Fc.
4. Añadir 1 μg de anti-CD19-APC (clon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clon: O323) y anti-CD38-PE (clon: HIT2) por cada 10⁶ células; mezclar bien e incubar en hielo durante 30 min.
5. En los últimos 5 minutos en el paso 1.4, agregue 5 μL de la comercial 7-amino actinomicina D (7-AAD).
6. Agregue 2 mL de PBS al tubo, vórtice y centrifugar a 600 x g durante 5 min.
7. Vuelva a suspender las células en un tampón de clasificación (PBS estéril con 2% de BSA y 2 mM de EDTA) a una concentración de 1 - 5 x 10⁷ células por ml en un tubo de 15 mL.
8. Filtre las células a través de un filtro de células de malla de nailon (tamaño de poro de 40 μm) para eliminar los grumos de células.
9. Separe las celdas con un clasificador de citometría de flujo equipado con tres láseres: violeta (405 nm), azul (488 nm) y rojo (640 nm).
   NOTA: El láser azul por sí solo es suficiente para la citometría de flujo de 3 colores.
10. Clasifique las células en tres tubos de 15 mL (que contienen 5 mL de medio RPMI) para la recolección simultánea de linfocitos B vírgenes (CD19⁺CD27^-), linfocitos B de memoria (CD19⁺CD27⁺) y PBs/PCs (CD19^+CD27+/hiCD38⁺).
    nota: Las células B ingenuas y de memoria clasificadas se pueden cultivar posteriormente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos Falcon de 15 mL	Halcón BD	352196
Colador de celdas de malla de nailon azul, 40 μm	Halcón BD	352340
CD19-APC antihumano	Bioleyenda	302212	clon HIB19
Antihumano CD27-eFluor 450	eBiociencia	48-0279-42	clon O323
Anti-humano CD38-PE-Cy7	Bioleyenda	303516	clon HIT2
Anti-humano CD38-PE-Cy7	BD Biociencias	560677	clon HIT2
Anti-humano CD45-FITC	Bioleyenda	304006	clon HI30
Anti-humano CD45-FITC	BD Biociencias	555482	clon HI30
Anti-ratón/rata/humano CD27- PerCP Cy5.5	Bioleyenda	124213	clon LG.3A10
Anti-humano CD27-PerCP Cy5.5	BD Biociencias	65429	clon L128
Anti-humano CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	clon LT19
Anti-humano CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	clon LT19
Anti-humano CD20-FITC	BD Biociencias	555622	clon 2H7
7-aminoactinomicina D (7-AAD)	BD Biociencias	559925
IgG humana	Jackson ImmunoResearch	009-000-003