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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
La sangre periférica humana debe obtenerse de donantes sanos bajo consentimiento informado, y el uso de muestras de sangre debe cumplir con las pautas aprobadas establecidas por las juntas de revisión. En este estudio, se utilizó el protocolo para utilizar sangre humana en una demostración de los resultados de la citometría de flujo (Figura 1) y los ensayos ELISpot (Figura 2).
1. Aislamiento y purificación de células B de sangre periférica humana
- Extraiga ~ 10 mL de sangre de la vena cubital mediana (en la fosa cubital anterior al codo) en un tubo de 15 mL que contenga K2EDTA (1.5 a 2.0 mg/mL de sangre) e invierta inmediatamente el tubo varias veces para prevenir la formación de coágulos.
- Añadir 35 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) esterilizado en autoclave (121 °C, 15 min) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 y 1 mM EDTA; pH 7,4) al tubo que contiene la muestra de sangre fresca (≥ 3:1 vol/vol) e incubar a temperatura ambiente (RT) durante no más de 5 min.
nota: La aparición de la transmisión de luz a través del tubo indica la finalización de la lisis de los glóbulos rojos.
- Centrifugar a 600 x g a RT durante 5 min. Asegúrese de que el pellet sea de color blanco.
- Vuelva a suspender el pellet con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato esterilizada en autoclave (PBS, 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM deNa2HPO4 y 1,47 mM de KH2PO4; pH 7,4) y centrifugar como en el paso 1.3.
- Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet con 10 mL de medio RPMI 1640 (suplementos: 10% de suero fetal de ternero, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B y 2 mM de L-glutamina) y luego coloque las células en una placa de cultivo de 10 cm (10 mL de sangre por placa). Coloque la placa en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 30 min.
- Agite suavemente la placa de cultivo unas cuantas veces y coloque el medio de cultivo (células de suspensión) en tubos cónicos de plástico de 15 ml. Deseche las células adherentes (principalmente macrófagos) en las placas de cultivo.
- Centrifugar a 600 x g a RT durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet con 1 mL de medio RPMI 1640. Cuente el número de células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
nota: La viabilidad de los leucocitos aislados es normalmente superior al 90% por exclusión del azul de tripano.
- Centrifugar como en el paso 1.7 y resuspender las células en ~ 200 μL de tampón PBS frío (0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de EDTA) a la concentración de 5 - 10 x 106 células/mL.
- Añadir 5 μL de cóctel Ab biotinilado anti-humano específico para células sanguíneas (para la selección negativa de células B) por cada 106 células e incubar en hielo durante 30 min.
nota: El cóctel anti-Ab humano debe incluir al menos Abs específicos para CD2 (o CD3), CD14 y CD16.
- Agregue un volumen 10 veces superior de PBS estéril a las células, centrifugue a 600 x g durante 5 minutos y deseche el sobrenadante.
- Agregue cantidades iguales de microperlas conjugadas con estreptavidina (5 μL por 10a 6 células) al pellet y mezcle bien.
- Incubar en hielo durante 30 min en un tubo cónico de plástico de 15 mL.
- Agregue 2 mL de tampón PBS en el tubo.
- Coloque el tubo en un soporte magnético e incube a RT durante 8 min. Las microperlas marrones se adherirán gradualmente a la pared del tubo junto al imán.
- Con el tubo restante en el soporte magnético, transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo estéril de 15 ml.
- Repita los pasos 1.14 a 1.16 y combine los dos sobrenadantes que contienen las células B intactas. Deseche las microperlas.
- Centrifugar a 600 x g a RT durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet en el medio RPMI 1640 para experimentos posteriores.
nota: Por lo general, se pueden aislar 1 - 5 x 105 células B con una pureza superior al 95% a partir de 10 mL de sangre periférica.
>2. Purificación y Separación de Células B Ingenuas y de Memoria de Células B Aisladas
- Utilice las células purificadas del paso 1 y determine el número de células utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células.
- Vuelva a suspender las células en 100 μL de tampón PBS frío después de la centrifugación a 600 x g y RT durante 5 min.
- Añadir 1 - 2 μg de mAb CD27 biotinilado por cada 106 células e incubar en hielo durante 30 min.
- Agregue 10 ml de tampón PBS al tubo y centrifugue a 600 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 50 μL de tampón PBS.
- Agregue cantidades iguales de microesferas magnéticas de estreptavidina (1 - 2 μg/106 células) a las células en un tubo cónico de plástico de 15 mL.
- Mezclar suavemente y hornear en hielo durante 30 min.
- Agregue 2 - 3 mL de tampón PBS al tubo.
- Coloque el tubo en un soporte magnético e incube a RT durante 8 minutos para permitir que las microperlas marrones se adhieran al lado más cercano al imán.
- Con el tubo en el soporte magnético, transfiera con cuidado la fracción sobrenadante a un nuevo tubo estéril. Esta fracción contiene los linfocitos B CD27 naïve enriquecidos.
- Agregue 5 ml al tubo que contiene las microperlas y vuelva a suspender suavemente las microperlas (es decir, la fracción enriquecida de las células B de memoria CD27+).
- Centrifugar a 600 x g en RT durante 5 min. Vuelva a suspender los gránulos con medio RPMI 1640 para los experimentos posteriores.
nota: Por lo general, ~ 30 - 60% de las células B se pueden purificar como células de memoria CD27 + a partir de las PBMC de un donante sano.
>3. Clasificación de células para la colección de células B vírgenes, células B de memoria y PBs/PCs
- Usando las células purificadas del Paso 1, determine el número de células usando un hemocitómetro o un contador automático de células.
- Vuelva a suspender las células en un tampón PBS frío a una concentración de 107 por ml en un tubo de poliestireno de 5 ml.
- Añadir 1 - 2 μg de IgG humana por cada 106 células e incubar en hielo durante 10 min para el bloque Fc.
- Añadir 1 μg de anti-CD19-APC (clon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clon: O323) y anti-CD38-PE (clon: HIT2) por cada 106 células; mezclar bien e incubar en hielo durante 30 min.
- En los últimos 5 minutos en el paso 3.4, agregue 5 μL de la comercial 7-amino actinomicina D (7-AAD).
- Agregue 2 mL de PBS al tubo, vórtice y centrifugar a 600 x g durante 5 min.
- Vuelva a suspender las células en un tampón de clasificación (PBS estéril con 2% de BSA y 2 mM de EDTA) a una concentración de 1 - 5 x 107 células por ml en un tubo de 15 mL.
- Filtre las células a través de un filtro de células de malla de nailon (tamaño de poro de 40 μm) para eliminar los grumos de células.
- Separe las celdas con un clasificador de citometría de flujo equipado con tres láseres: violeta (405 nm), azul (488 nm) y rojo (640 nm).
nota: El láser azul por sí solo es suficiente para la citometría de flujo de 3 colores.
- Clasifique las células en tres tubos de 15 ml (que contienen 5 ml de medio RPMI) para la recolección simultánea de células B vírgenes (CD19 + CD27-), células B de memoria (CD19 + CD27+) y PB / PC (CD19 + CD27 + / hiCD38 +).
nota: Las células B vírgenes y de memoria clasificadas se pueden cultivar como se describe en el paso 4.
>4. Diferenciación in vitro de células B CD19+ humanas aisladas, células B de memoria CD19+CD27+ y células B CD19+CD27- naïve
- Usando las células purificadas en los pasos 1.19, 2.10, 2.11 y 3.10, determine el número de células con un hemocitómetro o un contador automático de células.
- Vuelva a suspender las células con medio RPMI 1640 a una concentración de 1 - 10 x 105 por ml y alícuotas en los pocillos de una placa de 12 pocillos.
- Añadir CpG (ODN 2006) a 5 μg/106 células/mL.
- Cultivar las células en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 5 días.
- Coseche las células de cada pocillo, colóquelas por separado en tubos de 15 ml, agregue 5 ml de PBS a cada tubo y centrifuérrelas a 600 x g y RT durante 5 minutos.
- Cuente las células con un hemocitómetro o un contador automático de células. Resuspender las células a una concentración de 1 - 10 x 105 por mL con medio RPMI 1640.
>5. Ensayo ELISpot
- Añadir 30 μL de etanol al 35% en agua destilada a cada pocillo de las placas ELISpot durante 30 s.
nota: Al pipetear, evite tocar la membrana de los pocillos en todo momento.
- Invierta las placas ELISpot para eliminar el etanol.
- Coloque 150 μL de ddH2O esterilizado en autoclave en cada pocillo e incube en RT durante 5 min para eliminar el etanol residual; siga con un lavado de PBS estéril en RT durante 3 min.
nota: Los pasos 5.1 a 5.3 pueden ser opcionales, dependiendo de la fabricación de las placas.
- Poner 50 μL de 5 μg/mL de fragmento policlonal F(ab')2 de Ig antihumana (IgG + IgM + IgA) (en PBS) en cada pocillo de las placas ELISpot e incubarlas a 4 °C durante la noche (preferiblemente) o a 37 °C durante 2 h.
nota: Selle los bordes de las placas con Parafilm hasta su uso.
- Invierta las placas para eliminar el Abs suelto, agregue 200 μL de PBS a cada pocillo e incube dos veces a RT durante 3 minutos cada vez.
- Agregue 200 μL de PBS con BSA al 5% (o medio RPMI 1640) a cada pocillo para bloquear, e incube en RT durante 2 h.
- Invierta las placas para eliminar el tampón de bloqueo. Lave cada pocillo dos veces con 200 μL de PBS, como en el paso 5.5.
- Añadir 100 μL de medio RPMI 1640 a cada pocillo e incubarlos a 37 °C.
- Cuando esté listo para sembrar las celdas, invierta las placas para eliminar el medio RPMI 1640.
- Siembre 100 μL (5 x 104), 50 μL (2,5 x 104) y 25 μL (1,25 x 104) de las células (de los pasos 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 y 4.6) en los pocillos de una placa ELISpot. Con el medio RPMI 1640, lleve el volumen a 150 μL/pocillo.
nota: Se recomienda un mínimo de una o dos diluciones en serie de 2 veces para la siembra de las células.
- Incubar las placas en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 8 - 14 h. Evite mover las placas durante la incubación.
- Invierta las placas para quitar las celdas y el medio RPMI 1640.
- Añadir 200 μL/pocillo de PBS-T (PBS con 0,05% Tween 20) e incubarlos 5 veces a RT, cada vez durante 3 min. Invierta la placa para eliminar el tampón de lavado entre cada uno de los 5 lavados.
- Añada fosfatasa alcalina (AP) IgG antihumana en cabras, Abs específicos de Fcγ (para la detección de IgG, 1:5.000 en PBS-T) o IgM-AP antihumana en cabras, Abs específicos de fragmentos de Fcμ (para la detección de IgM, 1:5.000 en PBS-T) en los pocillos designados e incubar a RT durante 2 h en la oscuridad.
- Lave cada pocillo dos veces con 200 μL de PBS, como en el paso 5.5.
- Añadir 50 μL/pocillo de solución de sustrato de bromocloroindolil fosfato-azul nitro tetrazolio (BCIP/NBT). Las manchas de color púrpura normalmente aparecen en 5 a 15 minutos.
- Añadir 100 μL/pocillo de ddH2O para evitar el desarrollo excesivo de manchas.
- Enjuague las placas con agua corriente del grifo después del desarrollo completo de todas las manchas.
- Retire el desagüe inferior de las placas y deje que se sequen al aire en la oscuridad.
- Cuente las manchas utilizando un lector automático de placas con una unidad de adquisición/análisis de imágenes (por ejemplo, un escáner automático o manualmente a través de un microscopio de disección).
nota: Las placas pueden almacenarse en RT en la oscuridad y analizarse más tarde.
