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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de tubos de recolección
- Elabore el medio de cultivo BMSC complementando el Medio Esencial Mínimo α (MEM α) con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina/estreptomicina.
- Coloque 100 μL de medio de cultivo BMSC en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Por lo general, caben 3 huesos en un solo tubo, así que prepárese en consecuencia.
- Corte los extremos de las puntas de pipeta de 200 μL lo suficiente como para que quepan en los tubos de la centrífuga. Inserte las puntas dentro de los tubos y asegúrese de que las tapas puedan cerrarse antes de colocar los tubos en hielo.
nota: Alternativamente, se pueden insertar tubos de microcentrífuga de 0,75 mL con los extremos cortados en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
>2. Cosecha de huesos de ratones
- Sacrificar a los animales con CO2 seguido de luxación cervical y rociarlos con etanol al 70%
nota: Asegurar que se utilicen animales del mismo sexo y preferiblemente de la misma edad. Utilizamos habitualmente animales de 7 a 8 semanas de edad. Recomendamos agrupar células de al menos 3 animales por grupo experimental para producir una población celular más representativa y reproducible.
- Coloque al ratón sacrificado boca arriba sobre una tabla de disección. Use fórceps para crear una capa de piel en el abdomen. Haga una pequeña incisión (alrededor de 1 cm) con unas tijeras de disección estériles. Retire la piel hacia las extremidades y los pies desde el corte para exponer la parte inferior del abdomen y las piernas.
- Corte por debajo de la articulación del tobillo para quitar el pie. Corte a lo largo de la cresta ilíaca en la cadera para separar la cabeza del fémur del hueso de la cadera. Mientras el ratón todavía está boca arriba, haz una incisión en el medio del hueso de la cadera para separar los dos huesos ilíacos.
- Con toallitas sin pelusa, retire con cuidado el músculo de los fémures, las tibias y los huesos ilíacos.
nota: Cortar la mayor cantidad posible de tendones y músculos del hueso hace que la limpieza sea más rápida y fácil con las toallitas sin pelusa (por ejemplo, toallitas Kim). Tenga cuidado al manipular los huesos, ya que tienden a romperse fácilmente y su fragilidad puede aumentar con ciertos genotipos.
- Una vez que se hayan diseccionado todas las muestras, colóquelas en PBS sobre hielo y muévalas a una campana de cultivo estéril para los pasos restantes de aislamiento.
nota: Trabajar asépticamente tanto como sea posible reducirá el potencial de contaminación en los cultivos.
- Haga pequeños cortes (aproximadamente de 1 a 2 mm) en los extremos proximal y distal de los huesos antes de colocarlos en las puntas seccionadas dentro de los tubos de centrífuga.
nota: Asegúrese de cortar una cantidad suficiente para que la médula pueda ser centrifugada; Sin embargo, se debe tener cuidado de evitar cortar demasiado, ya que las poblaciones celulares tienden a variar según la proximidad dentro del espacio de la médula.
- Centrífuga a 10.000 x g durante 15 s a temperatura ambiente. Asegúrese de que toda la médula esté enjuagada y peletizada en la parte inferior del tubo de 1,5 ml mientras los huesos estén dentro de los insertos (ya sea punta de pipeta de 200 μl o tubo de microcentrífuga de 0,75 ml). Una vez que se haya recogido toda la médula, retire los insertos con los huesos de los tubos de recolección.
nota: Si se lava toda la médula, los huesos se verán blancos. Sin embargo, si queda médula en ciertos huesos, intente cortar los extremos nuevamente y centrifugar.
3. Suspensión de celdas
- Con una aguja de 25 G, tire de los gránulos de celda hacia arriba y hacia abajo lentamente para romper los grumos y combinar todas las muestras en un solo tubo cónico de 15 mL. Añadir 10 mL de medios de cultivo BMSC por cada 500 μL de muestras.
- Coloque un filtro de 70 μm encima de un tubo cónico de 50 mL y pase la suspensión celular a través de este filtro para eliminar posibles fragmentos óseos.
>4. Siembra y cultivo de poblaciones mixtas de células de médula ósea (BMC totales)
NOTA: Las células se cultivan a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2.
- Calcular el número de células y placharla a 1,0 x 106 células/cm2 en medios de cultivo. Espere 72 h de cultivo mixto para que las células se adhieran.
nota: Recomendamos diluir la suspensión celular 20 veces en medios de cultivo y diluir nuevamente en azul de tripán antes de contar las células con un hemocitómetro. En el caso de los ratones machos C57Bl6/J de 7 semanas de edad, obtenemos habitualmente un número de células de alrededor de 50 x 106 células, pero la edad, el sexo y la cepa pueden afectar en gran medida al número de células.
nota: Una población mixta de células debe adherirse en el fondo del pocillo de cultivo.
- Después de 72 h, retire el medio y reemplácelo con medio nuevo. Continúe cambiando los medios cada dos días y verifique la confluencia. Cuando las células alcanzan el 80-100% de confluencia, están listas para la diferenciación.
nota: Debido a que este cultivo se mezcla con BMSC y HSC, se puede usar directamente para la osteoblastogénesis, la adipogénesis y la osteoclastogénesis.
>5. Enchapado y cultivo de la población dividida de BMSCs (BMSCs adherentes)
NOTA: Las células se cultivan a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2.
- Coloque todas las células recolectadas de los fémures, tibias y huesos ilíacos de un ratón en una placa de cultivo de 10 cm (55cm2 de área de cultivo).
nota: Cuando agrupamos 2-3 ratones C57BL/6J, normalmente colocamos esta población "total" de médula ósea en un matraz de 150cm2.
- Después de 48 h de cultivo mixto, retire los medios de cultivo (que contienen las HSC no adherentes). Si se van a realizar experimentos de osteoclastogénesis, se debe dejar a un lado esta población de células no adherentes, si no, aspirar y descartar estas células.
- Lave cuidadosamente la placa/matraz con PBS para no alterar las celdas adjuntas.
- Retire el PBS y levante las células añadiendo tripsina al 0,25% e incubando a 37 °C durante 1-3 min. Apague la tripsina añadiendo medios celulares a la suspensión celular. En este punto, las BMSC, que ahora están levantadas, se pueden contar (como se hizo anteriormente en el paso 4.1) y platear para futuros experimentos.
- Calcule el número de celdas necesarias para el enchapado. Centrifugar el volumen requerido de suspensión celular a 1.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
nota: Por lo general, las células se platean en función de experimentos de punto final. Por ejemplo, si se va a aislar una proteína/ARN, normalmente se coloca una placa a una densidad más alta (~1,0-2,0 x 106 células/pocillo en una placa de 6 pocillos).
- Retire el medio y vuelva a suspender el gránulo de célula en el volumen de medio de cultivo necesario para el recubrimiento. Coloque las células en medios de cultivo de acuerdo con los experimentos y deje que se adhieran durante unos días. Cuando las BMSC alcanzan la confluencia, proceda a realizar la diferenciación.
>6. Diferenciación de las BMSC
- Adipocitos
- Elabore medios de base de adipocitos mezclando 90 mL de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose, 10 mL de Suero Fetal Bovino, 1 mL de Penicilina/Estreptomicina, 100 μL de 20 mM de Rosiglitazona y 100 μL de 2 mM de Insulina. Si es necesario, almacene este medio a 4 °C durante la semana durante el experimento de diferenciación.
- Elabore medios de inducción de adipocitos añadiendo 200 μL de 62,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) y 25 μL de dexametasona de 1 mM a 25 mL de medios de base de adipocitos.
- Una vez que los cultivos de BMSCs (ya sean BMC totales del paso 4.3 o BMSCs adherentes del paso 5.6) sean confluentes, cambie el medio a medio de inducción de adipocitos. Consideremos este Día 0 de diferenciación.
- Después de 48 h, retire el medio y refresque el cultivo con medio de inducción de adipocitos.
- En el día 4, cambie a adipocitos base media.
nota: Las gotas de lípidos pueden comenzar a aparecer ya el día 2 o el día 4.
- El día 7, observe que las células han acumulado el máximo de gotas de lípidos y muestran un fenotipo similar al de un adipocito maduro. No cultive más allá de este punto, ya que puede resultar en la muerte/desprendimiento de la célula.