Aislamiento de células T basado en flotación mediante clasificación de células activadas por flotabilidad

Resumen

Fuente: Snow, T., et al. Aislamiento, activación y expansión de células T basadas en flotación a partir de muestras de células mononucleares de sangre periférica humana utilizando microburbujas. J. Vis. Exp. (2022)

Este video muestra el aislamiento de células T de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando la tecnología de clasificación de células activadas por flotación funcionalizada (BACS). La técnica de aislamiento consiste en la selección positiva de linfocitos T CD3+ mediante el marcaje de las células con anticuerpos anti-CD3 biotinilados y la separación de las células unidas a anticuerpos mediante microburbujas unidas a estreptavidina.

Protocolo

1. Aislamiento de linfocitos T con microburbujas mediante selección positiva

NOTA: Este protocolo detalla un enfoque de selección positiva de CD3⁺ a pequeña escala utilizando SAMBs.

1. Incubar 3 x 10⁸ PBMC obtenidos comercialmente en 2,5 mL de tampón de separación con anticuerpo anti-CD3 (OKT3) biotinilado a una concentración de 25 ng de anticuerpo por 1 millón de células (25 ng/M). Mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.
2. Agregue microburbujas de estreptavidina (SAMB) en una proporción de 0.5 (cantidad de SAMB):1 (cantidad de celdas) de acuerdo con la concentración de SAMB informada por el fabricante.
3. Mezcle usando un rotador comercial de extremo a extremo (EOE) a 20 rpm durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar durante 5 min a 400 x g a temperatura ambiente.
4. Después de la centrifugación, las celdas seleccionadas positivamente estarán en la parte superior de la suspensión con los SAMB. Las celdas restantes no seleccionadas estarán en el pellet de celda en la parte inferior del tubo. Con una pipeta de vidrio de 9 pulgadas, inserte la punta debajo de la capa de células de burbujas hasta el fondo del tubo, aspire el pellet de células y el subnadante con una pipeta electrónica y transfiéralos a un nuevo tubo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Biotina anticuerpo CD3 humano (OKT3)	Bioleyenda	317320
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
PBMC humanos normales	BioIVT	HUMANOHLPB-0002562
Kit de microburbujas de estreptavidina (incluye el tampón de separación de Akadeum)	Akadeum	11110-000