Cultivo de células T activadas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana

Resumen

Fuente: Mølgaard, K., et al. Monitorización en tiempo real de la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citocinas. J. Vis. Exp. (2021).

En este video, describimos un protocolo para la activación de células T primarias humanas. La incubación de linfocitos T vírgenes con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, seguida de un tratamiento con interleucina-2 o interleucina-15, conduce a la activación de los linfocitos T naïve y a su diferenciación y proliferación en linfocitos T efectores o de memoria.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Cultivo de linfocitos T primarios humanos activados

1. Descongelación de células (Día 1)
   1. Precalentar 10 mL de RPMI 1640 por muestra a unos 37 °C.
   2. Tome el número deseado de ampollas de células mononucleares de sangre periférica y guárdelas temporalmente en hielo seco.
   3. Vuelva a suspender las células congeladas en 10 ml de RPMI 1640 precalentado.
   4. Centrifugar las células durante 5 min a 500 x g a RT.
   5. Deseche el sobrenadante y vuelva a lavar las células resuspendiendo en 10 mL de RPMI 1640 y centrifugando como se describe en 1.1.4.
   6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células a 2 x 10⁶ células por ml de medio X-VIVO 15 + 5% de suero humano (en adelante: medio de células T).
   7. Colocar 2 mL de células por pocillo en una placa de cultivo celular de 24 pocillos e incubar durante la noche a 37 °C y 5% de CO₂.
2. Activación de células (Día 0)
   1. Lave las perlas de CD3/CD28 transfiriendo 12,5 μL de perlas por cada millón de células a un tubo de microcentrífuga. Añadir 12,5 μL de PBS por cada 12,5 μL de perlas.
      nota: Es importante agitar el frasco de cuentas antes de usarlo.
   2. Coloque el tubo de microcentrífuga en un imán adecuado durante 1 min.
   3. Deseche el tampón y vuelva a suspender las perlas en el volumen original del medio de células T (12,5 μL de medio de células T por 12,5 μL del volumen original de perlas).
   4. Añadir 12,5 μL de perlas por millón de células, lo que corresponde a una proporción de 1:2 (perlas: células).
   5. Divida las células en dos condiciones con alrededor de 5 millones de células en cada una.
   6. Agregue el volumen correcto de citocinas a las condiciones mencionadas en la Tabla 1.
   7. Incubar las células durante 3 días a 37 °C y 5% de_CO2.
3. Cultivo de células (Días 3 y 5)
   1. Vuelva a suspender las células y divídalas transfiriendo la mitad del volumen de cada pocillo a un nuevo pocillo. Agregue el mismo volumen de medio de células T frescas a cada pocillo.
   2. Agregue nuevas citocinas a cada condición como se menciona en la Tabla 1.

	Citocina	acción	Factor de dilución	final
Condición 1	IL-2	3 x 106 U/mL	30.000	100 U/mL
Condición 2	IL-15	2 x 105 U/mL	2.000	100 U/mL

Tabla 1: Preparación de cultivos de citocinas utilizados para guiar los cambios metabólicos en las células T.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos	Nunc	142485
Perlas Anti-CD3xCD28	Gibco	11161D
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
Suero Humano	Sigma Aldrich	H4522	Calor inactivado a 56 °C durante 30 min
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Linfopp	Tecnologías de células madre	7801
Pbs	Termo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Imán de perlas de célula T DynaMag-2 Magnet	Termo Fisher	12321D