Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Aislamiento de una sola célula de PDLN
- Coloque una malla metálica estéril de 250 μm sobre un tubo cónico de 15 mL en una rejilla. Enjuague la malla con 1 mL de RPMI.
- Transfiera los ganglios linfáticos a la malla metálica y tritúrelos a través de la malla con un par de pinzas. Aplique 1 mL de RPMI en la malla metálica para enjuagar las células en el tubo. Repite 3 veces más y retira la malla.
- Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en aproximadamente 5 mL de RPMI. Llene los tubos con RPMI.
- Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en aproximadamente 5 mL de RPMI. Llene los tubos con RPMI.
- Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 2 mL de RPMI. Transfiera 2 mL de la suspensión de celdas a tubos de fondo redondo de 5 mL con tapas de filtro de celdas. Aplique la suspensión de celdas a las tapas del colador de celdas.
>2. Citometría de flujo
- Centrifugar las suspensiones celulares de PDLN a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Teñir las células con los siguientes anticuerpos de superficie en 100 μL de tampón de tinción por citometría de flujo (tampón FACS): 0,75 μg/100 μL de anticuerpo CD4 conjugado con FITC, 0,60 μg/100 μL de anticuerpo CD8 conjugado con APC-H7, 0,30 μg/100 μL de anticuerpo CD25 conjugado con PE, 5 μL (1:20) de anticuerpo Nrp1 conjugado con APC. Incuba los tubos en hielo durante 40 min.
- Agregue 200 μL de tampón FACS a cada tubo. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Repite una vez más.
- Fije y permeabilice las células resuspendiendo el pellet celular en 500 μL de tampón de fijación de permeabilización (PFB).
nota: El PFB se prepara mezclando 1 parte de concentrado de fijación/permeabilización con 3 partes de diluyente de fijación/permeabilización.
- Mantenga los tubos en la nevera a 4 °C durante toda la noche.
nota: Una incubación de 1 h también funciona.
- Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 500 μL de tampón de lavado de permeabilización (PWB). Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
nota: El PWB se prepara diluyendo el tampón de permeabilización (10x) a 1:10 en agua destilada.
- Teñir las células con los siguientes anticuerpos intracelulares en 100 μL de PWB: 0,30 μg/100 μL de anticuerpo Foxp3 conjugado con PE-Cy7, 4 μL (1:25) de anticuerpo Helios conjugado con PacificBlue. Incubar los tubos en hielo durante 1 h.
- Agregue 500 μL de PWB a cada tubo. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en 500 μL de PWB. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en 300 μL de tampón FACS.
- Analice las celdas en un citómetro de flujo.
- Limite las celdas individuales en función del área de dispersión lateral, la altura y la anchura, y el área de dispersión directa, la altura y la anchura. Ejecute un millón de eventos para su análisis.
- Exporte los archivos FCS de los experimentos y analícelos con el software analizador de citometría de flujo.
