Aislamiento de leucocitos hepáticos marginantes de un hígado de ratón

Resumen

Fuente: Sorski, L., et al. Recolección selectiva de leucocitos hepáticos marginantes. J. Vis. Exp. (2016)

En este video, demostramos el aislamiento de leucocitos hepáticos marginados del hígado de ratón por perfusión forzada.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Protocolo de ratón

1. Perfusión del hígado y recolección de leucocitos MH
   1. Eutanasiar al animal con una sobredosis de isoflurano al 8%. Como precaución, coloque un tubo de 15 ml que contenga una almohadilla empapada en isoflurano alrededor de la cabeza del ratón hasta abrir su cavidad torácica.
   2. Fija las extremidades del ratón a una cama.
   3. Abrir las cavidades peritoneal y torácica para exponer el hígado y el complejo cardiopulmonar inmediatamente después del cese de la respiración, manteniendo intacta la cara inferior del diafragma (para crear una piscina de drenaje de la cavidad torácica). Evite sangrar durante este proceso.
      1. Específicamente, comience la incisión en el punto de la línea media abdominal inferior, sin dañar los órganos internos, y progrese hacia ambos lados en diagonal hacia las costillas, cortándolas hasta los niveles superiores de la cavidad torácica.
   4. Saca los intestinos y colócalos fuera del animal a la derecha del experimentador, para exponer la vena porta.
   5. Inserte una aguja de 30 g, conectada a una bomba peristáltica en la vena porta rostral a la vena esplénica.
   6. Cortar la vena cava inferior por encima del diafragma para permitir el drenaje y la recolección del perfusado de la cavidad torácica.
   7. Encienda la bomba peristáltica a una velocidad aproximada de 3 ml/min y recoja suavemente los primeros 3 ml de perfusión contaminada con sangre de la piscina de la cavidad torácica.
   8. Deseche esta perfusión. Repita dicho lavado nuevamente si es necesario, usando solución salina, y solo entonces comience a recolectar la perfusión hepática.
   9. Reinicie la perfusión a una velocidad de hasta 4 ml/min y recoja 10 ml de perfusión de la cavidad torácica utilizando una mariposa conectada a una jeringa.
   10. Termina la perfusión cuando el color del hígado se vuelve marrón claro.

>2. Extracción de leucocitos

1. Centrifugar la perfusión durante 10 min a 400 x g.
2. Aspirar el sobrenadante.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bomba peristáltica Autoclud
Aguja de mariposa	Dios mío		26G
Aguja de mariposa	Dios mío		21G * 3/4 "
jeringa	Solución Pic		1 ml
jeringa	Solución Pic		2,5 ml
jeringa	Solución Pic		5 ml
jeringa	Solución Pic		10 ml
jeringa	Solución Pic		25 ml
Pinzas de borde romo
tijeras
Hemostático
Pinzas de tejido