Un método in vitro para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas

Resumen

Fuente: Perdomo, J., et al. Diferenciación de megacariocitos y formación de plaquetas a partir de células CD34+ derivadas de la sangre del cordón umbilical humano. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra una técnica para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas. Las células progenitoras madre hematopoyéticas, aisladas de la sangre del cordón umbilical humano, se diferencian en megacariocitos maduros en presencia de trombopoyetina. Los megacariocitos maduros producen extensiones citoplasmáticas denominadas proplaquetas, que dan lugar a plaquetas individuales.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Diferenciación de megacariocitos

1. Semilla 5 × 10⁵ células/mL de células CD34⁺ en 2 mL de SFM suplementadas con 50 ng/mL de trombopoyetina humana recombinante (rhTPO) por pocillo en una placa de 12 pocillos. Incubar las células a 37 °C, 5% de CO₂ en una atmósfera humidificada. Si las células confluyen antes de que sean necesarias para el análisis, recoseche las células y divídalas en varios pocillos con medios frescos y rhTPO.
   nota: Se deben preparar dos o tres pozos específicamente para monitorear la diferenciación en diferentes puntos de tiempo (por ejemplo, días 7, 9 y 10).
2. Recoja las células de los pozos reservados para controlar la diferenciación sin perturbar las células de los otros pozos.
3. Teñir las células con 20 μL de anticuerpo anti-GPIIb/CD41-FITC y 10 μL de anticuerpo anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 en un volumen final de 100 μL. Configure un tubo de control utilizando los anticuerpos de control de isotipo respectivos. Incubar durante 15 - 30 min a 4 °C.
4. Añadir 1 mL de SB al lavar. Centrifugar a 400 × g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 200 - 300 μL de SB. Analice por citometría de flujo.
5. Para cada fluoróforo, analice los controles de isotipo para establecer la compuerta para las poblaciones positivas de FITC y Alexa Flour 647. Analice las muestras de células teñidas para determinar el porcentaje de células dobles positivas CD41⁺/CD42a⁺, que representan MK maduras (Figura 1C).
6. Para la visualización microscópica de los marcadores de superficie celular, tiñe las células como se describe en 1.3.
   1. Añadir 1 mL de SB al lavar. Centrifugar a 400 × g durante 10 min. Vuelva a suspender el pellet en 100 μL de SB y gírelo sobre un portaobjetos de vidrio a 1.000 x g durante 5 min. Fije las células en el portaobjetos sumergiéndolas en metanol durante 30 s. Secar al aire, añadir 20 μL de medio de montaje que contenga DAPI (ver Tabla de Materiales), cubrir con un cubreobjetos y visualizar con un microscopio fluorescente (Figura 2A).
7. Para la visualización de antígenos intracelulares, resuspender las células en PBS y fijarlas con paraformaldehído (concentración final al 1%) durante 15 min a temperatura ambiente. Para permeabilizar las células, añadir triton-X 100 (0,1%) e incubar durante 15 min. Lave las celdas con 2 mL de PBS/0,1% triton-X 100. Vuelva a suspender en 100 μL de PBS/triton-X 100 al 0,1%, agregue anticuerpos anti-vWf y anti-CD62p (dilución 1:200) e incube durante 30 min a temperatura ambiente.
   1. Lavar con 2 mL de PBS/0,1% triton-X 100 y centrifugar a 400 × g durante 10 min, volver a suspender en 100 μL del mismo tampón y añadir IgG-Alexa 594 anti-ratón e IgG-Alexa 488 anti-conejo (1:100). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente, lavar con 2 mL de PBS/0,1% triton-X 100, resuspender en 100 μL del mismo tampón y añadir 20 μL de anti-CD42b-APC. A continuación, haga girar las células en portaobjetos de vidrio como se describe en el paso 1.6.1 y prepare las muestras para la visualización microscópica como se describe en el paso 1.6.1.
8. Para la determinación de la ploidía, recoja las células a los días 12 o 13 de diferenciación. Añadir 1 mL de SB al lavar. Centrifugar a 400 × g durante 10 min y teñir con 20 μL de anticuerpo anti-GPIIb/CD41-FITC en un volumen final de 100 μL. Incubar a 4 °C durante 30 min.
   1. Lavar una vez con 1 mL de SB y resuspender el pellet en 300 μL de tampón de citrato hipotónico (1,25 mM de citrato sódico, 2,5 mM de cloruro sódico, 3,5 mM de dextrosa) que contiene 20 μg/ml de yoduro de propidio y 0,05% de Triton-X 100. Incubar durante 15 min a 4 °C protegido de la luz.
   2. Añadir RNasa hasta una concentración final de 20 μg/mL e incubar durante 30 min a 4 °C protegido de la luz. Determinar la intensidad del yoduro de propidio mediante citometría de flujo mediante la recopilación de 30.000 a 50.000 eventos de la población CD41-FITC⁺ (Figura 2C).

>2. Recuento de proplaquetas, enumeración de plaquetas y activación de plaquetas

1. Coseche las células (del paso 1.1) a los días 8 o 9 de diferenciación y siembre a 1 × 10 4 células/pocillo en placas de 48 pocillos en 200 μL de SFM fresco suplementado con 50 ng/mL de rhTPO. Cultivo durante 5 días a 37 °C, 5% CO₂.
   nota: Para fines de cuantificación, los pocillos de semillas se triplican. Esta baja densidad es necesaria para la visualización y el recuento de la MK portadora de proplaquetas. Las proplaquetas suelen empezar a aparecer después de 2 días de cultivo. El pico es entre los días 4 y 5.
2. Cuente el número de MK portadores de proplaquetas en todo el pocillo en un microscopio de luz invertida utilizando objetivos de 10X o 20X.
   nota: Es preferible una platina de microscopio calentada (37 °C), ya que mantener las células a temperatura ambiente durante períodos prolongados provoca la contracción de las extensiones proplaquetarias. Las proplaquetas se observan como extensiones largas del cuerpo MK. Cada MK puede tener varias protuberancias proplaquetarias. A medida que se desarrollan las proplaquetas, el cuerpo de la MK disminuye de tamaño.
3. Recolectar las celdas y centrifugar a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Tiñir las células con 20 μL del anticuerpo CD41-FITC humano, como se describe en los pasos 1.3 y 1.4. Calcule el porcentaje de MK portador de proplaquetas (pbMK):
   pbMK (%) = [(MK portadores de proplaquetas/pocillo) / (Total de células CD41+/pocillo)] x 100
4. Para contar las plaquetas liberadas en el medio de cultivo, mezcle suavemente las células con una pipeta Pasteur y recoja 100 μL a los días 14 o 15 de cultivo.
   1. Tinción con 20 μL de anticuerpo anti-humano CD41-FITC durante 20 - 30 min a 4 °C. Configure un tubo de control utilizando el anticuerpo de control del isotipo correspondiente.
   2. Agregue 150 μL de SB y 50 μL de cuentas de conteo.
   3. Para el análisis de citometría de flujo, establezca el FSC y el SSC en la escala de registro. Utilice plaquetas de sangre humana normales a partir de plasma rico en plaquetas teñido con CD41-FITC como se describe en la sección 2.4.1 para establecer la compuerta de las plaquetas (Figura 3A).
   4. Analice las plaquetas teñidas mediante el recuento de perlas por citometría de flujo. Recopile 1.000 eventos de conteo de cuentas utilizando el diagrama de dispersión FSC versus SSC (Figura 3A). Calcule el número de plaquetas en función de los eventos positivos para CD41-FITC (Figura 3B) utilizando la fórmula:
      Plaquetas por μL=[(número de eventos positivos para CD41-FITC)/1.000 perlas)] x [(nº� de perlas en 50 μL)/volumen de la muestra)]
5. Para analizar la activación plaquetaria, mezcle suavemente las células con una pipeta Pasteur y recoja 100 μL a los 14 o 15 días de cultivo. Añadir 1 mL de tampón Tyrode (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 1 mM de MgCl₂, 1,8 mM de CaCl₂, 0,2 mM de Na₂HPO₄, 12 mM de NaHCO₃, 5,5 mM de D-glucosa, pH 6,5) y centrifugar a 200 x g durante 5 min para las células de pellets.
   1. Recoja el sobrenadante y centrifugue a 800 x g durante 10 min para pellets de partículas del tamaño de plaquetas.
   2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en 100 μL de tampón Tyrode. Añadir 20 μL de anticuerpo PAC1-FITC y difosfato de adenosina (ADP) hasta una concentración final de 20 μM. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min. Analice por citometría de flujo para determinar el porcentaje de eventos positivos para FITC. Utilice plaquetas humanas frescas tratadas de la misma manera que un control positivo (Figura 3C).

Resultados

Figura 1: Gráficos de citometría de flujo de aislamiento de células CD34+ y diferenciación de MK en cultivo. (A) Las células mononucleares (cerradas como se muestra en el panel izquierdo) purificadas de sangre de cordón umbilical humano se tiñeron con anticuerpo anti-CD34-PE para determinar el porcentaje de células CD34⁺ en la muestra (1,3%, panel derecho). (B)

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos de cultivo celular
TPO humano recombinante	Miltenyi Biotec	130-094-013
VástagoEnvergadura SFEM II	Tecnologías de células madre	9605	Medios sin suero para células CD34+
Citometría de flujo y reactivos de tinción celular
Ratón PE anti-humano CD34	BD Biociencias	340669	Clon 8G12. Esto se puede utilizar para la verificación de pureza de CD34. Concentración final de anticuerpos: dilución 1:10.
Ratón PerCP anti-humano CD45	BD Biociencias	347464	Dilución 1:10
Control de isotipo por CP	BD Biociencias	349044	Dilución 1:10
FITC Ratón anti-humano CD41a	BD Biociencias	340929	Concentración final de anticuerpos: dilución 1:5.
Ratón APC anti-humano CD42b	BD Biociencias	551061	Este anticuerpo también se puede utilizar para detectar MK maduras (el porcentaje de células positivas suele ser menor que el de anti CD42a). Concentración final de anticuerpos: dilución 1:10.
Alexa Fluor 647 Ratón anti-humano CD42a	AbD Serotec	MCA1227A647T	Actualmente distribuido por Bio-Rad. Concentración final de anticuerpos: dilución 1:10.
Alexa Fluor 647 Control negativo del ratón	AbD Serotec	MCA928A647	Actualmente distribuido por Bio-Rad. Anticuerpo de control de isotipo
Factor anti von Willebrand conejo policlonal	Abcam	AB6994	Dilución 1:200
Ratón V450 anti-humna CD41a	BD Biociencias	58425	Dilución 1:20
Control de isotipo V450	BD Biociencias	580373	Dilución 1:20
Anticuerpo PAC1-FITC	BD Biociencias	340507	Dilución 1:10
Anti CD62p monoclonal de ratón	Abcam	AB6632	Dilución 1:200
Alexa Fluor 488 cabra anti conejo IgG	Invitrogen	A11008	Dilución 1:100
Alexa Fluor 594 cabra anti ratón IgG	Invitrogen	A11020	Dilución 1:100
Cóctel de control de isotipo Ig-C	BD Biociencias	558659	Anticuerpo de control de isotipo
Yoduro de propidio	Sigma Aldrich	P4864
CountBright Cuentas Contadoras Absolutas	Sondas moleculares, Invitrogen	C36950	Contar cuentas
materiales
Tubos FACS de polipropileno de fondo redondo Falcon de 5 mL, con tapón a presión, estériles	Tecnologías in vitro	352063
Portaobjetos de vidrio	Menzel-Glaser	J3800AMNZ
Medios de montaje con DAPI	Laboratorios de vectores	H-1200	Medio de montaje antidecoloración con DAPI
equipo
Microscopio invertido	Leica	Microscopio invertido DMIRB
Microscopio fluorescente	Zeiss	Vert.A1
Analizador de células	BD Biociencias	FACS Canto II
Centrífuga Cytospin	Termocientífico	Cytospin 4
software
Software de analizador de células	BD Biociencias	Software FACS Diva
Software de análisis de célula única	Estrella del árbol	FlowJo
Software de microscopio fluorescente	Zeiss	Zen 2 edición azul