$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. 3D Cultivo de órganos tímicos para generar iTE
- Extraiga lóbulos tímicos fetales de ratón y despliegue linfocitos endógenos mediante tratamiento con desoxiguanosina (dGUO).
- En el día 7 del tratamiento con dGUO, tome cuatro platos nuevos de 10 cm y llene cada uno con 20 mL de medio completo (Roswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanil-L-glutamina + 1x piruvato de sodio + 1x medio esencial mínimo con aminoácidos no esenciales (MEM-NEAA) + 1x penicilina-estreptomicina + [1:1000] etanol 2-mercapto).
- Transfiera todas las membranas de nitrocelulosa con lóbulos tímicos a un plato de 10 cm. Separe los lóbulos individuales de la membrana con pinzas, permitiendo que se sumerjan en el medio. Deseche las membranas. Incubar durante 1 h en RT.
- Transfiera los lóbulos tímicos a una nueva placa de 10 cm con medios completos e incube durante 1 h en RT. Repita este paso 2 veces más.
- Con pinzas, fije los lóbulos tímicos a la placa (uno a la vez) y con la otra mano haga una incisión profunda de 100 a 200 μm en el centro y extienda la mitad del diámetro del lóbulo para facilitar la migración de los progenitores de las células T al lóbulo.
- Transfiera los lóbulos tímicos a una nueva placa de 10 cm llena de medios de diferenciación completos (medios completos + 5 ng/mL de interleucina-7 de ratón (IL-7) + 5 ng/mL de ligando Flt3 de ratón (FLT3L) + 5 ng/mL de factor de células madre (SCF)).
- Opcionalmente, si utiliza placas de cultivo 3D con rejillas de nivel inferior y superior, llene ambas rejillas con PBS estéril para evitar la evaporación y el secado de las gotas colgantes.
- Transfiera 30 μL de medio completo que contenga un lóbulo tímico tratado con dGuo del paso 1.6 a cada pocillo de la placa de cultivo 3D.
- Recoja células de linaje T no adherentes (células T inmaduras derivadas de iPSC) del cocultivo OP9/DLL1 (días 16-21) y vuelva a suspender a 2–5 x 103 células de linaje T por medio de 20 μL.
- Agregue 20 μL de suspensión de células de linaje T a cada lóbulo tímico en la placa de cultivo 3D. Incubar durante la noche a 37 °C con 5% de CO2.
- Ajuste la pipeta P200 a 30 μL y aspire el medio después de pipetear varias veces de cada pocillo para eliminar todas las células que rodean los lóbulos tímicos. Deseche el medio y agregue 30 μL de medio completo. Repita este procedimiento de 5 a 7 veces para eliminar las células T inmaduras adicionales que no migran a los lóbulos. A partir de entonces, cambie de 25 a 30 μl de medio al día.
- Confirmar la formación de un halo de emigrantes tímicos derivados de iPSC (iTE) alrededor de los lóbulos a partir de los días 4-5 mediante microscopía óptica.
- Recoja iTE diariamente mediante medios de pipeteo sin alteración del lóbulo. Cambie los medios todos los días y continúe la recolección hasta por aproximadamente 12 días.
- Los iTE recolectados están listos para su uso en análisis moleculares (Figura 1, Figura 2, Figura 3 y Figura 4) o en experimentos de trasplante in vivo.
