Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Expansión de las células NK de los tejidos hepáticos (Día 0), como se muestra en la Figura 1.
NOTA: El número inicial de células y la viabilidad están fuertemente correlacionados con el tiempo transcurrido desde la extracción del órgano y la cantidad inicial de la muestra de tejido. Sin embargo, si los tejidos se colocan en 30 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y se mantienen en hielo o en la nevera a 4 °C durante la noche, las células NK aún pueden expandirse a alta pureza y viabilidad hasta 24 horas después.
- Identificar áreas de tejido viables para obtener linfocitos a partir de tejidos y secciones utilizando equipos quirúrgicos estériles.
- Coloque los pañuelos en 30 ml de HBSS (sin calcio o magnesio) y manténgalos en hielo hasta que estén listos para prepararse para el aislamiento.
- Picar el pañuelo en cubos de <0,5 cm con hojas de afeitar estériles o tijeras y pinzas dentro de un armario de bioseguridad.
- Prepare una solución de colagenasa IV 1x (1 mg/mL) diluyendo un caldo 10x en HBSS (10x colagenasa IV: 10 mg/mL o ~200 U/mL).
- Coloque los trozos de tejido picado en los tubos disociadores de tejido. Llene los tubos con no más de 4 g de tejido y sumerja los trozos de tejido en ~ 10 mL de 1x colagenasa IV.
nota: No se recomienda el uso de DNasa I, ya que puede disminuir ligeramente la viabilidad y el rendimiento de NK. Consulte la Tabla de materiales para conocer los tubos disociadores de tejido específicos utilizados.
- Coloque los tubos disociadores de tejido en un disociador de tejido y mezcle a 37 °C para picar bien el tejido.
nota: En el caso del tejido hepático, esto puede tardar más de 30 minutos. Para tejidos más friables, unos 15 minutos pueden ser suficientes. Consulte la Tabla de materiales para conocer los tubos disociadores de tejidos específicos y el disociador de tejidos utilizado.
- Retire los tubos disociadores de tejido y triture a través de un colador de células de nailon de 40 μm utilizando el extremo posterior de una jeringa de 5 mL. Recoja el eluyente y deseche los fragmentos grandes sin digerir.
- Girar el eluyente a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender los gránulos celulares en sílice recubierta de polivinilpirrolidona (PVP) al 30% para eliminar las células grasas que, de otro modo, contaminarían la fracción final de linfocitos.
- Para preparar 1x sílice recubierta de PVP, utilice una dilución de 9:1 de sílice recubierta de PVP en 10x PBS.
nota: Consulte la Tabla de materiales para conocer la sílice recubierta de PVP específica utilizada.
- Para preparar un 30% de sílice recubierta de PVP, diluya 1x sílice recubierta de PVP con PBS/HBSS.
- Gire el pellet de celda a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en 9 mL de medio R-10.
nota: Consulte la Tabla de materiales para conocer la composición de los medios R-10
- Coloque cuidadosamente la suspensión celular sobre 4 mL de Ficoll o medio de separación de linfocitos para separar los linfocitos de los glóbulos rojos y las células polimorfonucleares.
- Separe las capas centrifugando a 400 x g durante 23 min a temperatura ambiente con la aceleración y los frenos apagados o en el ajuste más bajo. Decantar cuidadosamente la capa media-alta y recolectar la interfase que contiene linfocitos infiltrantes de tejido.
- Enjuague las células con 10 ml de medio y proceda al recuento de células, citometría de flujo, alícuotas y congelación de células, o protocolo de expansión primario de NK.
>2. Expansión primaria de células NK a partir de PBMCs (o CB o tejidos de órganos) (Día 0), como se muestra en la Figura 2.
- Descongele la PBMC congelada y las celdas alimentadoras congeladas e irradiadas en un baño de agua a 37 °C.
- Lave las células PBMC y 100 células 221-mIL-21 irradiadas con rayos gamma (irradiadas con Gy) por centrifugación a 400 x g durante 5 minutos con 10 mL de medios R-10 por separado.
- Guarde 1 x 106 células de PBMC para citometría de flujo.
nota: La pureza inicial de la célula NK es un factor importante en el cálculo de la tasa de expansión de la célula NK.
- Vuelva a suspender las células en 1 mL de medio R-10. Cuente las celdas con Trypan Blue.
- Mezcle 5 x 106 células de PBMC con 10 x 106 células de 221 mIL-21 irradiadas con 100 Gy en una placa especial de 6 pocillos (consulte la Tabla de materiales).
- Agregue 30 mL de medio R-10 suplementado con IL-2 humana (200 U/mL) e IL-15 humana (5 ng/mL) (ver Tabla de Materiales).
- Incubar la placa especial de 6 pocillos a 37 °C con 5% de CO2.
- Reemplace el medio con medio R-10 suplementado con IL-2 humana (200 U/mL) e IL-15 humana (5 ng/mL) para mantener las células NK cada 3-4 días><.
nota: Mantenga menos de 20 x 106 celdas por pocillo para una mayor expansión en cada cambio de medio. Para obtener la mejor viabilidad, asegúrese de que el número total de celdas en cada pocillo no exceda las 100 x 106 celdas.
- Registre el número total de células, la viabilidad y realice la citometría de flujo cada 3-4 días para calcular la tasa de expansión de las células NK.
