Un In vitro para la preparación funcional del receptor de glucocorticoides (GR) • hsp90 complejos de proteínas de las proteínas purificadas y lisados celulares se describe. El método utiliza inmunoadsorción de GR recombinante seguido por la sal-stripping y la reconstitución de proteínas complejas. La importancia de los cofactores y las condiciones de amortiguación se discuten, como lo son las posibles aplicaciones del método.
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Artículo de método
La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando
En este artículo
Resumen
Resumen
Hsp90 es una proteína chaperona molecular esencial y muy abundante que se ha encontrado para regular más de 150 proteínas eucariotas de señalización, incluyendo los factores de transcripción (por ejemplo, los receptores nucleares, p53) y las proteínas quinasas (por ejemplo, Src, Raf, Akt cinasa) que participan en el ciclo celular, tumorigénesis, la apoptosis, y múltiples vías de señalización 1,2 eucariotas. Muchos de estos "clientes" de las proteínas hsp90, el montaje de receptores de esteroides • hsp90 complejos es el mejor definidos (Figura 1). Presentamos aquí un receptor adaptable glucocorticoides (GR) ensayo de inmunoprecipitación e in vitro GR • hsp90 método de reconstitución que puede ser fácilmente utilizada para explorar eucariotas hsp90 actividad funcional, hsp90 mediada por ligando de unión al receptor de esteroides, y los requisitos de cofactor molecular acompañante. Por ejemplo, este ensayo puede ser utilizado para probar los requisitos de hsp90 cofactor y los efectos de la adición de compuestos exógenos al proceso de reconstitución.
El GR ha sido un sistema muy útil para el estudio de hsp90 porque el receptor debe estar enlazado a hsp90 para tener una unión del ligando libre hendidura que sea accesible a los esteroides 3. GR endógeno, unliganded está presente en el citoplasma de las células de los mamíferos no covalentemente unido a hsp90. Como se encuentra en la GR • hsp90 endógeno heterocomplex, la unión del ligando GR hendidura abierta y capaz de unirse con esteroides. Si hsp90 se disocia de los recursos genéticos o si su función se inhibe, el receptor es incapaz de unirse con esteroides y requiere la reconstitución de la GR • hsp90 heterocomplex antes de la actividad de unión de esteroides se restaura 4. GR se puede immunoprecipitated de citosol de la célula utilizando un anticuerpo monoclonal, y las proteínas, tales como hsp90 complejos con el GR se puede analizar por Western blot. Actividad de unión de los esteroides GR immunoprecipitated se puede determinar mediante la incubación de la immunopellet con [3H] esteroides.
Los experimentos anteriores han demostrado hsp90 mediada por la apertura de la unión del ligando GR hendido requiere Hsp70, una chaperona molecular segundo también es esencial para la viabilidad de las células eucariotas. Actividad bioquímica de HSP90 y HSP70 son catalizadas por la co-Hop acompañante proteínas HSP40, y 5 de p23. Una maquinaria acompañante multiproteico que contiene HSP90, HSP70 Hop, y HSP40 son endógena presente en el citoplasma de la célula eucariota, y lisado de reticulocitos proporciona una acompañante-rica fuente de proteínas 6.
En el método presentado, GR es immunoadsorbed de citosol de la célula y despojado de la maquinaria acompañante endógeno hsp90/hsp70 con condiciones suaves de sal. El GR-sal despojado se incuba con lisado de reticulocitos, ATP, y K +, lo que resulta en la reconstitución de la GR • hsp90 heterocomplex y la reactivación de la actividad de unión de esteroides 7. Este método puede ser utilizado para probar los efectos de varios cofactores acompañante, nuevas proteínas, y los inhibidores de HSP90 experimental o GR con el fin de determinar su significado funcional de hsp90 mediada por esteroides vinculante 11.08.
Protocolo
1. Preparación de citosol de la célula que contiene GR funcional
- Nota técnica: Todos los tampones se deben refrigerar y cada paso de este protocolo, incluyendo centrifugaciones y la incubación, se debe realizar en hielo oa 4 ° C, a menos que se indique lo contrario. La baja temperatura es esencial para prevenir la degradación de los complejos de GR y proteínas.
- Utilizando una centrífuga refrigerada, obtener un ~ 1.5 ml de precipitado de células que expresa una alta concentración de GR funcional. Ejemplos de fuentes de células ricas en recursos genéticos incluyen fibroblastos de ratón L929, las cuales expresan una alta concentración de GR endógeno....
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Discusión
El ensayo descrito anteriormente se puede adaptar para poner a prueba un gran número de condiciones que afectan a las acciones acompañante de la maquinaria acompañante hsp90/hsp70-based así como enlazar GR esteroides. Se trata de una modificación de los métodos previamente reportados 4,8,9,17 y está diseñado para aprovechar los avances recientes en tecnología de electroforesis y ser accesible a una comunidad de investigación más amplio. Cofactores adicionales o proteínas de interés se pueden añadir a la GR • .......
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Divulgaciones
Seleccionar los reactivos de electroforesis y el software de análisis de imágenes fueron proporcionadas por Bio-Rad.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM086822, Hope Heart Institute premio de Ciencias Básicas, y el MJ Murdock Charitable Trust Programa Facultad de Ciencias de la Investigación. Seleccionar los reactivos de electroforesis y el software de análisis de imágenes fueron generosamente proporcionadas por Bio-Rad.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Células de insecto Sf9 | Invitrogen | para la expresión de baculovirus recombinante de ratón GR | |
| Células L929 | ATCC | CRL-2173 | endógeno del ratón GR citosol preparación (alternativa a la expresión de baculovirus) |
| FiGR células hibridoma | ATCC | CRL-2173 | para la preparación de ascitis que contiene anti-GR anticuerpo monoclonal (alternativa a los anticuerpos purificados BuGR2) |
| Completa Mini-inhibidor de la proteasa, EDTA libre | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| proteína A-Sepharosa | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| lisado de reticulocitos de conejo | Hectáreas verde (Oregon, WI) | rica fuente de maquinaria endógena acompañante hsp90/hsp70 | |
| creatinfosfocinasa | Sigma-Aldrich | C3755 | de ATP-sistema de regeneración |
| fosfocreatina | Sigma-Aldrich | P7936 | de ATP-sistema de regeneración |
| anti-GR anticuerpo monoclonal de ratón (BuGR2) | Pierce / Thermo Scientific | MA1-510 | utilizado para GR inmunoadsorción y los anticuerpos primarios como en el Western Blot |
| anti-HSP90 anticuerpo monoclonal de ratón (AC88) | Enzo Ciencias de la Vida | ADI-SPA-830 | utilizado como anticuerpo primario en el Western Blot |
| anti-HSP70 anticuerpo monoclonal de ratón (N27F3-4) | Enzo Ciencias de la Vida | ADI-SPA-820 | utilizado como anticuerpo primario en el Western Blot |
| IgG de suero de ratón | Sigma-Aldrich | 038K7690 | utilizados como anticuerpos inmunes para el control negativo de inmunoadsorción |
| IgG anti-ratón-peroxidasa | Sigma-Aldrich | A4416 | utilizó como anticuerpo secundario en el Western Blot |
| Experion microfluidos sistema de electroforesis | Bio-Rad | 7007001 | alternativa a las SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7 - 3 H] dexametasona | PerkinElmer | NET1192001MC | seguir las precauciones de seguridad |
Referencias
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M.
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Reimpresiones y permisos
