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1. Preparación de portaobjetos para adherir células Raji
- Añadir 150 μL de fibronectina (100 μg/mL) por pocillo a un portaobjetos de 8 micropocillos (portaobjetos de cámara con fondo de plástico) e incubar durante 30 min a 1 h a 37 °C. Este sustrato de adhesión permitirá la unión de las células Raji al fondo del pozo (Paso 2), la formación de conjugados vivos con células Jurkat (Paso 4) y la captura de microscopía de lapso de tiempo (Paso 6), y también es compatible posteriormente con la fijación opcional de paraformaldehído (PFA).
NOTA: Para la fijación de acetona, use portaobjetos de cámara con fondo de vidrio y poli-L-lisina (20 μg / mL) en lugar de fibronectina, ya que la acetona disuelve el plástico. El portaobjetos de 8 micropocillos (1 cm2 pocillos, 300 μL de volumen máximo) o equivalente es un formato flexible y adecuado.
- Aspirar la fibronectina con una pipeta automática de 200 μL y lavar cada pocillo con 200 μL de PBS durante 2 min agitando suavemente. Repite este lavado una vez más. El portaobjetos de la cámara se puede almacenar en esta etapa con PBS durante 1-2 semanas a 4 °C.
>2. Adhesión de las células Raji a los portaobjetos de la cámara y marcaje de 7-amino-4-clorometilcumarina (CMAC)
- Transfiera 10 mL de un precultivo confluente (1-2 x 106 células/mL) de células Raji a un tubo de 15 mL con fondo en V. Mezcle bien y use 10 μL para contar las celdas en la cámara de Neubauer o equivalente.
- Centrifugar las células restantes a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender suavemente el pellet celular en un medio de cultivo completo tibio (RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS, 2 mM de glutamina, 10 mM de HEPES, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) a una concentración de 106 células/mL. Utilice la ecuación que se da a continuación:
([ ]inicial x Vinicial = [ ]final x Vfinal), donde [ ]inicial representa la concentración celular inicial, Vinicial = volumen inicial de la suspensión celular, [ ]final = concentración celular final, Vfinal = volumen final de la suspensión celular.
NOTA: Dependiendo de la concentración celular del cultivo inicial, es posible recolectar más células de las necesarias, pero es importante mantener las células restantes en cultivo (37 °C) hasta el final del experimento para evitar posibles problemas (ver Paso 2.6).
- Etiquete las células Raji para permitir su identificación durante la formación de conjugados sinápticos. En este experimento, el marcaje de 7-amino-4-clorometilcumarina (CMAC) se realiza en el paso 2.4.2.
- Transfiera el número requerido de células Raji en el medio de cultivo a un tubo de 2 mL. Para los 8 portaobjetos de la cámara de micropocillos, se necesita un total de 1,6 mL de la suspensión celular (200 μL por pocillo).
- Agregue CMAC hasta una concentración final de 10 μM. Mantenga las células en la oscuridad cubriendo el tubo con papel de aluminio, ya que el CMAC es sensible a la luz. Se necesitan 200 μL que contengan 2 x 105 células Raji por pocillo de 1 cm2. Por lo tanto, si es necesario preparar 8 pozos, se requieren 1,6 x 106 celdas Raji.
NOTA: El etiquetado de las células Raji con azul rastreador de células (CMAC, excitación UV y emisión de azul) las distingue de las células Th cuando se forman los conjugados sinápticos. Este colorante es compatible con los fijadores de PFA y acetona y permite otros procedimientos de inmunofluorescencia. Trate de evitar la exposición a la luz. El marcaje de las células Raji en un grupo con CMAC seguido de una resuspensión antes de la adhesión de las células Raji a los portaobjetos de la cámara recubiertos de fibronectina garantiza el marcaje homogéneo de las células Raji con CMAC entre los diferentes pocillos.
- Vuelva a suspender las células teñidas con CMAC y, después de la aspiración del PBS en el portaobjetos de la cámara del paso 1.2., transfiera 200 μL de la suspensión celular a cada pocillo de los portaobjetos de la cámara recubiertos de fibronectina preparados en los pasos 1.1-1.2. Incubar el portaobjetos de la cámara a 37 °C, 5% CO2 durante 30 min-1 h.
NOTA: La adhesión y el etiquetado CMAC se producirán simultáneamente en este paso y esto ahorra tiempo. Tenga en cuenta que las células Raji se sedimentarán rápidamente y se debe tener cuidado para mantener una concentración homogénea en la suspensión celular antes de la siembra. No es necesario lavar el CMAC en esta etapa por centrifugación, ya que el lavado del CMAC se realizará más fácilmente en el paso 2.7 (cuando las células Raji marcadas ya se han adherido a los portaobjetos de la cámara). Dado que el CMAC está presente en la suspensión celular en gran exceso, el fondo de fluorescencia azul es demasiado alto para distinguir las células teñidas de azul. Compruebe la fluorescencia de la célula CMAC en el paso 2.7 después del lavado de CMAC.
- Asegúrese de que las células Raji se adhieran al fondo de los pocillos agitando suavemente los portaobjetos de la cámara en el microscopio. Asegúrese de que las celdas muestren espacios entre sí y no sean confluentes (Figura 1, panel central). El 50-60% de la confluencia celular es apropiado.
- Si la mayoría de las células se adhieren eficazmente al portaobjetos de la cámara y no se observan espacios entre las células, lave cada pocillo con un medio completo tibio y vuelva a suspender el medio con una pipeta automática de 200 μL para separar el exceso de células. Compruebe la confluencia después de cada paso de resuspensión.
- Si las células no se adhieren, repita el paso de adhesión de nuevo y aumente el tiempo de adhesión y/o el número de células.
NOTA: Es posible detenerse aquí, incubar el portaobjetos de la cámara a 37 °C, 5% de CO2 durante la noche (O/N) y continuar con el protocolo al día siguiente. Confirme al día siguiente que las células Raji permanecen adheridas y marcadas con CMAC mediante el uso de microscopía de fluorescencia.
- Lave cada pocillo nuevamente cuidadosamente con RPMI suplementado tibio para eliminar el exceso de CMAC y verifique la emisión de azul con el microscopio de fluorescencia (Figura 1).
NOTA: Para evitar el uso de aceite de inmersión (pegajoso y viscoso) y objetivos de aceite de alta apertura numérica, se pueden usar objetivos de distancia extra larga (es decir, 20x o 40x) para verificar rápidamente el etiquetado CMAC usando el microscopio de fluorescencia.
>3. Pulso de CMAC — Células Raji marcadas con enterotoxina estafilocócica E
- Agregue enterotoxina E estafilocócica (SEE, 1 μg/mL) a cada pocillo. El SEE puede diluirse convenientemente en un medio de cultivo celular (solución de trabajo a 100 μg/mL) a partir de las existencias congeladas del SEE (1 mg/mL en PBS). Utilice 2 μL de la solución de trabajo 100x por cada 200 μL de micropocillo.
PRECAUCIÓN: Use guantes para este paso y deseche la punta usada en la caja de riesgo biológico.
- Incubar el portaobjetos de la cámara a 37 °C, 5% de CO2 durante al menos 30 min. El efecto SEE dura al menos 3-4 h.
NOTA: Se puede agregar SEE a los pozos en diferentes puntos de tiempo cuando sea necesario si se planean configuraciones de lapso de tiempo distintas (paso 5) y / o dependiendo del punto de tiempo de inicio para los experimentos de punto final (paso 6).
>4. Preparación de las células de Jurkat
- Utilice un cultivo previo de células Jurkat (1-2 x 106 células/mL) para este experimento. Utilice células de un matraz de cultivo estándar o de una transfección previa siguiendo los protocolos de electroporación estándar, como se ha descrito anteriormente. La transfección de células Jurkat permitirá la visualización en lapso de tiempo del tráfico de gránulos secretores en células vivas. Por ejemplo, cuando se expresa GFP-CD63 (un marcador de MVB), se puede registrar el movimiento de las vesículas decoradas con GFP-CD63.
- Observe las células bajo un microscopio de contraste de fase. Si se observa un exceso de células muertas (>20-30%), realice la centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll utilizando protocolos estándar, para eliminar el exceso de células muertas (las células muertas exhiben una mayor densidad que las células vivas) antes de su uso (ver Discusión).
- Transfiera las células a un tubo de 15 mL, un tubo de fondo en V, y use 10 μL para contar con un hemocitómetro.
- Centrifugar las celdas restantes como se describe en el paso 2.2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células a la misma concentración que las células Raji (1 x 106/mL) utilizando un medio de cultivo fresco y tibio. Siga los pasos 2.2-2.3.
- Mantenga las células de Jurkat en cultivo (37 °C, 5% CO2) mientras espera el paso 4.
NOTA: En la segunda opción (transfección), el número de células vivas va a ser mucho menor que en la primera. Por lo tanto, considere la posibilidad de utilizar un volumen de cultivo celular inicial más alto para tener suficientes células para el experimento. De 10 x 106 células Jurkat por cubeta de electroporación y transfección, solo 2-4 x 106 células Jurkat sobrevivirán después de 48 h de transfección y algunas de estas células se perderán durante el paso Ficoll. Por lo tanto, una cubeta de electroporación es generalmente suficiente para desafiar las celdas Raji pulsadas SEE adheridas de 8 micropocillos (se necesitan1,6 x 10 6 celdas Jurkat transfectadas).
5. Co-siembra de Células Raji y Jurkat
- Saque de la incubadora los portaobjetos de la cámara que contienen las células Raji adheridas marcadas con CMAC, pulsadas por SEE del paso 3.2. No es necesario lavar el CMAC en esta etapa, ya que esto se hizo anteriormente en el paso 2.7.
- Aspirar cuidadosamente el medio de cultivo de cada pocillo, uno por uno, desde una esquina del pocillo utilizando una pipeta automática de 200 μL. No deje que el medio del pozo se seque por completo.
- Sustituya inmediatamente el medio por 200 μL de células Jurkat resuspendidas en un medio de cultivo celular (1 x 106/mL) preparado en el paso 4.5. Si se realizan imágenes de lapso de tiempo, vaya al paso 6 inmediatamente después de este paso, ya que las células Jurkat tienden a sedimentarse y formar conjugados sinápticos muy rápidamente. Para mayor comodidad, los micropocillos que contienen células Raji adheridas y pulsadas por SEE que no reciben siembra con células Jurkat en esta etapa deben mantenerse con un medio de cultivo celular hasta el desafío posterior con células Jurkat. Esto permitirá de manera flexible desafíos posteriores con células Jurkat para enfoques experimentales adicionales de punto final de lapso de tiempo o cinética inversa.
- Si se va a realizar un lapso de tiempo, proceda rápidamente al paso 6. Esto implica el cocultivo durante 1-2 h en la incubadora de etapa de microscopio o equivalente a 37 °C, 5% de CO2 para permitir la formación de conjugados sinápticos y la adquisición simultánea de imágenes. Si se prevé un análisis de punto final, pero no un lapso de tiempo, verifique la formación de conjugados después del período de cocultivo utilizando el microscopio (como en la Figura 1) antes de fijar las células.
>6. Imágenes de lapso de tiempo de conjugados sinápticos emergentes
- Prepare el microscopio y la cámara de incubación antes de la toma de imágenes. Para el ejemplo, los ajustes detallados de la microscopía se muestran en la Figura 2.
NOTA: Si se planea un experimento de lapso de tiempo, se deben preparar todos los ajustes y complementos del microscopio (cámara de cultivo celular ambiental, etc.) antes de agregar la suspensión de Jurkat al portaobjetos de la cámara con células Raji adheridas. Se describen los siguientes pasos para un microscopio comercial (Tabla de materiales). Sin embargo, se puede utilizar cualquier microscopio de fluorescencia invertida equipado con una incubadora de cultivos celulares.
- Utilice un microscopio con una inmersión en aceite de 60x y una alta apertura numérica cuando obtenga imágenes del tráfico polarizado.
- Asegúrese de que el sistema de enfoque automático esté activado y ajuste el desplazamiento para enfocar las celdas Raji unidas a la superficie inferior. Consulte la Figura 1.
- Después de la adición de Jurkat a cada pocillo que contiene las células Raji adheridas en el paso 5.3, ubique rápidamente el portaobjetos de la cámara de micropocillos en la incubadora de etapa de microscopio precalentada (1-2 h) (es decir, OKOlab) y seleccione algunas posiciones XY con el microscopio, campos en los que es probable que registre una formación de IS emergente realizada, por ejemplo, por una célula transfectada por Jurkat que cae en el foco del microscopio.
- Utilice una incubadora de platina de microscopio precalentada, ya que se observó que una platina estabilizada por temperatura mantiene estables las posiciones X, Y, Z. Los criterios para un campo XY conveniente son: células Raji bien enfocadas y no confluentes (es decir, que muestran espacios entre las células) y la presencia de células Jurkat transfectadas (esto se puede comprobar combinando transmitancia y canales UV o GFP). Las células Jurkat se sedimentarán muy rápidamente (unos pocos minutos) en el portaobjetos de la cámara, y las posibilidades de obtener imágenes de las sinapsis emergentes disminuirán con el tiempo (Figura 1). Es posible terminar el experimento después del lapso de tiempo definido o continuar con el Paso 7 y fijar los conjugados para la inmunofluorescencia y los análisis posteriores.
NOTA: Es posible seleccionar hasta 16 campos de microscopio diferentes de hasta 4 micropocillos diferentes para la adquisición simultánea de lapsos de tiempo de varios pocillos con la resolución temporal adecuada (1-2 minutos por fotograma). La limitación se basa tanto en el número como en la intensidad (que afecta a la exposición de la cámara) de los diversos fluorocromos que se van a fotografiar (dependiendo del número de proteínas fluorescentes expresadas, aparte de CMAC). Una forma de aumentar la velocidad de fotogramas es grabar para el canal CMAC en solo uno de cada "n" marcos de tiempo para GFP (es decir, n = 8, como se muestra en la Figura 2) ya que las celdas Raji se adhieren al fondo del pozo y no se mueven fácilmente como las celdas Jurkat. Además, esto beneficia la viabilidad de la célula, ya que la exposición frecuente a la luz ultravioleta puede dañar las células. Intente ajustar la velocidad de fotogramas de tiempo a 1 fotograma cada 1 minuto o menos (es decir, 20 s por fotograma, Figura 2), ya que la polarización de MVB tarda unos minutos u horas en completarse. Es necesario un microscopio equipado con una torreta de epifluorescencia motorizada y filtros de fluorescencia de paso de banda apropiados o equivalentes para realizar esta captura multicanal.
