Reconocimiento de marcadores CD de células asesinas inducidas por citocinas humanas mediante citometría de flujo

Resumen

Fuente: Hsiao, C. H., et al. Aislamiento y expansión de linfocitos T asesinos inducidos por citocinas citotóxicas para el tratamiento del cáncer. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos una técnica basada en citometría de flujo para determinar la proporción de células T asesinas inducidas por citocinas, células CIK, expandidas a partir de un cultivo de células mononucleares de sangre periférica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Inducción y expansión de CIK

1. El día 0, cultive las PBMC (1 x 10⁶) en medio basal fresco que contenga 1.000 UI/mL de IFN-γ durante 24 h en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 °C y 5% de CO₂.
2. El día 1, refresque el medio con medio basal fresco que contenga 50 ng/mL de anticuerpo anti-CD3, 1 ng/mL de IL-1α rh y 1,000 U/mL de IL-2 rh. Refresque el medio cada 3 días.
3. El día 7, refresque el medio con medio basal fresco que contenga 1,000 U/mL de IL-2 rh. Refresque el medio cada 3 días hasta el final de la expansión celular (día 14).

>2. Inmunofenotipado para la evaluación de células CIK

1. Lave las células CIK con 10 mL de PBS estéril. Centrifugar durante 10 min a 300 x g y 18−20 °C, aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 10 mL de PBS. Cuente el número de células y pruebe la viabilidad de las células mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano.
2. Alícuota las células CIK en seis tubos estériles de 1,5 mL a una densidad de ~5–10 x 10⁵ células/mL de PBS. Etiquete y trate de la siguiente manera: Tubo 1, en blanco (sin anticuerpos); Tubo 2, añadir 20 μL del isotipo IgG1-FITC; Tubo 3, añadir 20 μL de isotipo IgG1-APC mAbs; Tubo 4, añadir 20 μL de CD3-FITC; Tubo 5, añadir 20 μL de CD56-APC mAbs; y Tubo 6, añadir 20 μL de CD3-FITC y 20 μL de CD56-APC mAbs.
3. Mezcle suavemente las células CIK con los anticuerpos pipeteándolas suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces con una pipeta estéril de 1 mL, y luego incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
4. Centrifugar los tubos durante 10 min a 300 x g y 18-20 °C. Aspirar el sobrenadante y suspender el pellet de la célula una vez con 1 mL de PBS. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces con una pipeta estéril de 1 mL.
5. Repita el paso 2.4.
6. Deje los tubos en la oscuridad antes del análisis citométrico de flujo.

>3. Reconocimiento de marcadores de CD

1. Transfiera la suspensión celular a un tubo inferior redondo estéril de poliestireno de 5 ml con una tapa de filtro de celdas (malla de 100 μm) pipeteando suavemente a través de la tapa. Coloque los tubos en el carrusel en orden.
2. Abra el software de análisis de citometría de flujo y cree una carpeta experimental. Haga clic en el botón Nueva muestra para agregar una muestra y un tubo al experimento y asigne un nombre a los tubos de la siguiente manera: Tubo 1, en blanco; Tubo 2, isotipo IgG1-CD3; Tubo 3, isotipo IgG1-CD56; Tubo 4, CD3; Tubo 5, CD56; Tubo 6, CD3CD56.
3. Cree un sistema de compuerta de dispersión para las poblaciones de células CIK (Figura 1A).
   1. Seleccione Tubo 1 (en blanco) y haga clic en el botón Diagrama de puntos para crear un gráfico FSC-A/SSC-A. Dibuje una puerta rectangular sobre toda la población de celdas con un umbral FSC-A >5 x 10⁴ para excluir los residuos de celdas.
   2. Seleccione el parámetro SSC-A/SSC-H para el nuevo diagrama de puntos y dibuje una puerta de polígono alrededor de todas las celdas individuales. Seleccione los parámetros Recuento/FITC (CD3) y Recuento/APC (CD56) para la nueva gráfica de histograma, respectivamente. Seleccione el parámetro FITC (CD3)/APC (CD56) para el nuevo diagrama de puntos y dibuje una puerta de cuatro cuadrantes para definir las cuatro subpoblaciones.
   3. Registre los datos de 20.000 células individuales en cada muestra. Haga clic en el botón Cargar muestra para analizar primero la muestra de control en blanco. Identifique toda la población de células CIK mediante los parámetros de los canales CD56 y CD3.
4. Repita el paso 3.3 para la investigación de todos los especímenes.
5. Abra los archivos que contienen los valores estadísticos de la muestra individual para analizar las poblaciones de células CIK y vuelva a imprimirlos en archivos de análisis.

Resultados

Figura 1: Proporción de linfocitos T CD3⁺CD56⁺ de una muestra representativa de PBMC.(A) Los linfocitos se reconocieron por tamaño y granularidad específicos. Población de células individuales seleccionada para análisis por citometría de flujo. (B) El análisis estadístico de la eficacia de la expansión de CIK de tres donantes sanos se realizó mediante una prueba t (*, p < 0,...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo CD56 antihumano para ratones APC	Bd	555518	B159
Ratón APC IgG1, control de isotipo κ	Bd	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Citómetro de flujo	Bd	338962	SN: R33896202856
Águila Modificada de Dulbecco Mediana/F12	HyClone	SH30023.02	Medio basal para el cultivo de células OC-3
Suero fetal bovino	HyClone	SH30084.03	Para cultivo celular K562 y OC-3. El medio completo contiene un 10% de FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Ciencias de la Vida	71101700-EK	Solución de gradiente de densidad
FITC Anticuerpo CD3 antihumano para ratones	Bd	555332	UCHT1
FITC Ratón IgG1, κ Control de Isotipo	Bd	555748	MOPC-21
AcM anti-CD3 humano	Takara	T210	OKT3 Añadir 2,5 mL de caldo (1 mg/1 mL) a 50 mL de medio de inducción. Stock de almacenamiento a -80 °C
RPMI1640 medio	Gibco	11875-085	Medio basal para cultivo celular K562. Stock de almacenamiento a 4 °C