Ensayo para la identificación de la secreción de interferón gamma en órganos linfoides murinos

Resumen

Fuente: Mazet, J. M., et al. Imagen de la producción in situ de interferón gamma en el bazo del ratón tras una infección por Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un método de imagen para visualizar in situ la secreción de interferón-gamma (IFN-γ) en el bazo del ratón. Después de la infección bacteriana y la inducción de la acumulación de IFN-γ dentro de las células T y las células asesinas naturales, el bazo se extrae del ratón. Al obtener secciones de tejido, se realiza una inmunotinción para visualizar el IFN-γ dentro de las células.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Transferencia adoptiva de células T CD8+ específicas de antigénicos en ratones

1. Aísle células T CD8⁺ (OTI) específicas de ovoalbúmina (OVA) que expresan proteína verde fluorescente (OTI-GFP) o proteína roja fluorescente (OTI-RFP) de la suspensión de ganglios linfáticos de ratones transgénicos con receptor de células T utilizando un kit de aislamiento de células T CD8⁺ de ratón según las instrucciones de fabricación. Prepare la suspensión celular aplastando los ganglios linfáticos con un émbolo de jeringa, como se describió anteriormente.
2. Transfiera células OTI-GFP u OTI-RFP (3 x 10⁶ células) a ratones C57BL/6 de tipo salvaje receptores mediante inyección intravenosa como lo describe Cahalan, et al. Utilice ratones que suelen tener entre 6 y 12 semanas de edad.
   nota: Este paso es opcional y solo es necesario para el seguimiento de las células T CD8⁺ específicas del antígeno.

>2. Infección por Listeria monocytogenes

1. Expandir L. monocytogenes modificado genéticamente para expresar OVA (LM-OVA) a una fase exponencial de crecimiento en infusión de corazón en caldo a 37 °C bajo agitación suave hasta que el OD600 alcance 0.08-0.1, como se describió anteriormente.
2. Inyectar 100 μL (volumen máximo = 200 μL) de 0,1–0,5 LM-OVA DL50 diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) por inyección intravenosa utilizando una jeringa de insulina de 29 G, en ratones C57BL/6 de tipo salvaje que porten células OTI-GFP u OTI-RFP cuando esté indicado.
   nota: En nuestras manos, 0,1 x LD50 LM-OVA corresponde a 2 x 10⁴ unidades formadoras de colonias (UFC). L. monocytogenes modificada genéticamente para expresar OVA se utiliza para activar las células T OTI CD8⁺ previamente transferidas, pero se pueden utilizar otras cepas de L. monocytogenes.

>3. Tratamiento con Brefeldina A (BFA) para bloquear la secreción de citocinas

1. Inyectar 250 μg de BFA en 200 μL de PBS por vía intraperitoneal durante 6 h antes del sacrificio en ratón utilizando una jeringa de insulina de 29 G.
   nota: El BFA liofilizado se resuspende primero en dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar una concentración de 25 mg/mL. A continuación, el BFA se diluye en PBS a temperatura ambiente (RT) para evitar la cristalización antes de la inyección. La inhibición de la secreción de citocinas induce la acumulación de IFNγ en las células. Esto es crucial para la detección de citocinas.

>4. Cosechando el bazo

1. Eutanasiar a los ratones utilizando concentraciones crecientes de CO₂ seguidas de dislocación cervical.
   nota: Siga las pautas de la institución local para la eutanasia humanitaria de ratones.
2. Limpie el abdomen con etanol al 70% y haga una incisión con unas tijeras para hacer un corte de 1 a 2 cm a través de la piel en el flanco izquierdo del ratón, donde se encuentra el bazo. Haga con cuidado una incisión en el peritoneo para exponer el bazo y sáquelo con pinzas. Extraiga el bazo, teniendo cuidado de no apretarlo con fórceps o cortarlo para evitar alterar la arquitectura del bazo.

>5. Fijación del bazo con paraformaldehído (PFA)

1. Prepare la solución fijadora mezclando 3,75 mL de PBS y 3,75 mL de L-lisina 0,2 M. Añadir 21 mg de m-periodato de sodio y mezclar bien. A continuación, añada 2,5 mL de PFA al 4% y 20 μL de NaOH.
   nota: Utilice la solución fijadora el mismo día y deseche el exceso. No lo guarde. Este paso de fijación es importante si la muestra contiene proteínas fluorescentes como GFP. No utilice PFA que contenga trazas de metanol, ya que desnaturaliza las proteínas fluorescentes.
   cautela: El PFA es tóxico y debe manipularse con precaución.
2. Sumerja el bazo en el fijador y fíjelo durante un mínimo de 4 h, normalmente de 16 a 20 h a 4 °C bajo una agitación suave.
3. Deseche la solución fijadora y agregue 5 mL de PBS durante 5 min a RT bajo agitación suave.
4. Sustituya el PBS por 5 ml de PBS fresco e incube durante 1 h a 4 °C con una agitación suave.
5. Reemplace el PBS con 5 mL de sacarosa al 30% e incube durante 12-24 h.
   nota: Este método ayuda a mantener la morfología del tejido. Después de la incubación con solución de sacarosa, el órgano debe hundirse en el fondo del pozo.

>6. Congelación y seccionamiento

1. Coloque hielo seco en un recipiente grande y coloque un recipiente más pequeño adentro que contenga alrededor de 50 ml de metanol puro y algunos trozos de hielo seco.
2. Seque suavemente el bazo con una toallita sin pelusa.
3. Coloque el bazo dentro de un molde base que contenga una gota de compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) en la parte inferior. Tenga cuidado de no producir burbujas. Agregue OCT sobre el bazo.
4. Con pinzas, deposite el molde base en la superficie del metanol, asegurándose de que no toque el OCT. Congele el tejido lo más rápido posible para minimizar los artefactos.
5. Cuando esté congelado, proceda con el seccionado.
   nota: El bazo congelado puede mantenerse a -80 °C durante varios meses.
6. Seccionar el tejido con un criomicrótomo.
   1. Ajuste la temperatura de la cámara en el criostato a -21 °C. Corte secciones del grosor deseado (generalmente alrededor de 10 μm). Este protocolo funciona con espesores de hasta 30 μm.
7. Recoja secciones en portaobjetos de microscopio de vidrio (consulte la Tabla de Materiales) e inspeccione visualmente.
   nota: Las secciones se pueden mantener a -80 °C durante varios meses.

>7. Tinción inmunofluorescente

1. Permita que la sección llegue a RT.
2. Dibuje un círculo con un bloqueador líquido (por ejemplo, una pluma PAP) alrededor de la sección de tejido. Dibuja fuera de la OCT o no se pegará.
3. Una vez que se haya secado, rehidrate la muestra colocando PBS en la sección de tejido durante 5 min.
   nota: El volumen puesto en la sección depende del tamaño de la sección. Por lo general, usamos de 100 a 300 μL. No dejes que las secciones se sequen una vez que estén rehidratadas.
4. Enjuague con PBS al menos dos veces para asegurarse de que la sección esté bien adherida al portaobjetos.
5. Agregue una solución de bloqueo a la sección para disminuir la unión inespecífica de los anticuerpos.
   1. Prepare la solución de bloqueo de la siguiente manera: PBS con Triton X100 al 0,1%, suero fetal de ternero (FCS) al 2%, bloqueador del receptor Fc a 2,5 μg/mL (anti-ratón CD16/32). A continuación, añada un 2-5% de suero normal de las especies de cada anticuerpo secundario del panel de tinción.
      nota: Si los anticuerpos están directamente conjugados/biotinilados, añadir un 5% de suero normal de las especies de cada anticuerpo primario. Si un anticuerpo primario y uno de los anticuerpos secundarios son de la misma especie (por ejemplo, anticuerpo primario criado en conejo y anti-rata secundario en conejo), no utilice la especie de suero normal, ya que aumentará la señal de fondo.
   2. Retire suavemente el PBS de la sección por aspiración y añada 100 μL de la solución de bloqueo por sección de muestra. Incubar en una cámara húmeda cubierta durante un mínimo de 1 h a RT.
6. Tinción con anticuerpos primarios.
   1. Diluir los anticuerpos primarios a la concentración óptima en la solución bloqueante. El punto de partida general de concentración de anticuerpos es de 5 μg/mL, pero debe optimizarse para cada anticuerpo y tejido.
      nota: Si los anticuerpos se conjugan directamente, centrifugar la mezcla de anticuerpos a 17,135 x g (13,500 rpm) durante 15 minutos a 4 °C antes de usarla. Los fluoróforos pueden precipitar. Este paso granulará los precipitados y, por lo tanto, evitará la deposición inespecífica de los anticuerpos precipitados en el portaobjetos.
   2. Reemplace la solución de bloqueo con la mezcla de anticuerpos primarios para cada muestra.
   3. Incubar durante 4 h a RT o durante la noche (OVN) a 4 °C en una cámara húmeda cubierta.
7. Realiza el lavado.
   1. Prepare el tampón de lavado agregando un 2% de FCS al PBS.
   2. Lavar 4 veces con tampón de lavado: una rápida (sin incubación), una de 10 min y dos de 5 min. A continuación, realice un lavado final con PBS durante 5 min.
8. Tinción con anticuerpos secundarios.
   1. Diluir los anticuerpos secundarios de interés a la concentración óptima en la solución bloqueante. Centrifugar la mezcla, como se describe para los anticuerpos primarios.
   2. Retire la solución de lavado final. Agregue la mezcla de anticuerpos secundarios en la parte superior de la sección e incube durante 1-4 h a RT en una cámara húmeda cubierta.
9. Lavar 4 veces con tampón de lavado: una rápida (sin incubación), una de 10 min y dos de 5 min. A continuación, realice un lavado final con PBS durante 5 min.
10. Retire la solución de lavado final. Deje que el PBS se evapore, pero no seque demasiado la sección. Coloque una gota del medio de montaje encima de la muestra y coloque con cuidado el cubreobjetos encima. El medio de montaje debe recuperar toda la sección. Déjelo polimerasa OVN en RT protegido de la luz.
    nota: Dibuje un círculo alrededor de la sección en el reverso de la guía antes de aplicar el medio de montaje. Una vez que se aplica el medio de montaje, el tejido puede volverse difícil de ver.
11. Guarde las diapositivas en la oscuridad a 4 °C hasta que estén listas para tomar imágenes.

>8. Imágenes y análisis

1. Realice la imagen de la tinción con un microscopio confocal.
   nota: En este protocolo, se utilizó un microscopio de barrido láser espectral invertido (ver Tabla de Materiales), junto con los objetivos 10x/NA 0.40 o 60x/NA 1.4 (para el análisis de la localización subcelular de citocinas). Las longitudes de onda de excitación y emisión se muestran para cada fluoróforo y proteína fluorescente en la Tabla de Materiales.
2. Realice análisis y cuantificación según sea necesario utilizando software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, Imaris o Fiji).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Brefeldin A	Biociencia de Cambridge	CAY11861
Paraformaldehido	Agar científico	R1018
Dihidrocloruro de L-lisina	Ciencias de la vida Sigma	L5751
Metaperiodato de sodio	Termo Científico	20504
D(+)-sacarosa	Productos químicos de VWR	27480.294
Toallitas de precisión papel Kimtech ciencia	Kimberly-Clark Profesional	75512
Compuesto O.C.T., medio de montaje para criotomía	Productos químicos de VWR	361603E
Bloque Fc, anti-ratón purificado CD16/32, clon 93	Bioleyenda	101302	Clon de anticuerpo y concentración utilizada: 2,5 mg/ml
Portaobjetos de microscopio - Superfrost Plus	Productos químicos de VWR	631-0108
anti-CD169 - AF647	Bioleyenda	142407	Clon de anticuerpo y concentración utilizada: clon 3D6.112 1,6 mg/ml
			Longitud de onda de excitación: 650
			Longitud de onda de emisión: 65
anti-F4/80 - APC	Bioleyenda	123115	Clon de anticuerpo y concentración utilizada: clon BM8 2,5 mg/ml
			Longitud de onda de excitación: 650
			Longitud de onda de emisión: 660
anti-B220 - PB	Bioleyenda	103230	Clon de anticuerpo y concentración utilizada: clon RA3-6B2 1,6 mg/ml
			Longitud de onda de excitación: 410
			Longitud de onda de emisión: 455
anti-IFNg - biotina	Bioleyenda	505804	Clon de anticuerpo y concentración utilizada: clon XMG1.2 5 mg/ml
anti-IFNg - BV421	Bioleyenda	505829	Clon de anticuerpo y concentración utilizada: clon XMG1.2 5 mg/ml
			Longitud de onda de excitación: 405
			Longitud de onda de emisión: 436
anti-Nkp46/NCRI	Sistemas de investigación y desarrollo	AF2225	Clon de anticuerpo y concentración utilizada: cabra 2,5 mg/ml
anticaprino IgG-FITC	Novusbio	NPp 1-74814	Clon de anticuerpo y concentración utilizada: 1 mg/ml
			Longitud de onda de excitación: 490
			Longitud de onda de emisión: 525
Estreptavidina - PE	Bioleyenda	405203	Clon de anticuerpo y concentración utilizada: 2,5 mg/ml
			Longitud de onda de excitación: 565
			Longitud de onda de emisión: 578
estreptavidina - FITC	Bioleyenda	405201	Clon de anticuerpo y concentración utilizada: 2,5 mg/ml
			Longitud de onda de excitación: 490
			Longitud de onda de emisión: 525
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
Cubreobjetos 22x40mm	Menzel-Glazer	12352128
Bloqueador de líquidos super PAP PEN mini	Axxora	CAC-DAI-PAP-S-M
Imaris - Software de análisis de imágenes por microscopía	Plano de bits
Microscopio confocal - Olympus FV1200 Microscopio láser de barrido	Olimpo
Criostato - CM 1900 UV	Leica
Molde base desechable	Fisher Scientific Reino Unido Ltd	11670990
PBS 1X	Tecnologías de la Vida Ltd	20012068
Caldo BHI	Marca VWR	303415ZA
GFP			Longitud de onda de excitación: 484
			Longitud de onda de emisión: 507
Rfp			Longitud de onda de excitación: 558
			Longitud de onda de emisión: 583
Jeringa de insulina, con aguja, 29G	VWR Internacional	BDAM324824
Ratones de tipo salvaje C57BL/6	Río Charles