Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Purificación de plaquetas
NOTA: La purificación de las plaquetas debe realizarse a temperatura ambiente para evitar su degradación. Asegúrese de que la temperatura de los reactivos e instrumentos esté entre 18 y 22 °C. Para prevenir la degradación de las plaquetas, se debe evitar el pipeteo rápido y la agitación vigorosa durante el procedimiento.
- Añadir 600 μL de medio de gradiente de iohexol (polvo de iohexol al 12% en cloruro de sodio al 0,85%, 5 mM de tricina, pH 7,2) en un tubo de 1,5 mL.
- Añada 200 μl de muestra de sangre lentamente por el lateral del tubo sobre el medio de gradiente con una punta de pipeta de diámetro ancho para que la sangre y el medio de iohexol no se mezclen (Figura 1A).
- Centrifugar el tubo contenedor de la muestra a 400 x g durante 20 min a 20 °C en un rotor de cangilón oscilante con aceleración y desaceleración lentas.
- Recoja la mayor parte de la capa rica en plaquetas y una pequeña fracción de la capa pobre en plaquetas (total de 300 a 400 μL) utilizando una punta de pipeta de diámetro ancho sin alterar las capas de glóbulos rojos y leucocitos (Figura 1B). Transfiera la muestra de plaquetas a un nuevo tubo.
nota: Si el recuento de plaquetas es menor en la sangre o se utiliza un volumen más pequeño de sangre, la capa rica en plaquetas y la capa pobre en plaquetas se pueden ver como una sola capa.
- Añadir 1 mL de PBS a la muestra de plaquetas, mezclar invirtiendo y centrifugar a 800 x g durante 10 min a 20 °C en un rotor de cubo oscilante. Deseche la solución por completo y agregue 200 μL de PBS para resuspender las plaquetas con un pipeteo suave.
nota: Este paso es opcional, ya que elimina el medio de gradiente y las proteínas plasmáticas y aumenta la sensibilidad de las plaquetas a agonistas como la trombina. Dado que las diferentes centrífugas tienen diferentes programas, la aceleración/desaceleración lenta se puede determinar leyendo el manual del usuario de la centrífuga.
- Transfiera 30 μL de esta muestra a un tubo nuevo para contar las plaquetas. Las plaquetas restantes se pueden utilizar para ensayos bioquímicos y fisiológicos como la activación de plaquetas, la agregación, la liberación de gránulos, etc.
- Para la extracción de ARN o proteínas, centrifugar la muestra de plaquetas a 800 x g durante 10 min para granular las plaquetas. Deseche el sobrenadante por completo sin alterar el pellet. Añadir el volumen deseado de ARN o tampón de lisis de proteínas para lisar las plaquetas.
>2. Activación plaquetaria
- En un tubo, agregue de 1 a 2 millones de plaquetas purificadas en hasta 100 μL de tampón de tinción (PBS con suero fetal bovino al 2%, FBS).
- Para un número múltiple de muestras, haga una mezcla maestra de anticuerpos con 1 μL (0,5 mg/mL) de los siguientes métodos: PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119, PE rat rat anti-mouse CD45, FITC rat anti-mouse CD41 y APC rata anti-ratón/humano CD62P (P-selectin) para detectar glóbulos rojos, leucocitos, plaquetas y plaquetas activadas, respectivamente. Agregue la mezcla maestra a los tubos para teñir las células. No agregue trombina.
- En otro tubo, agregue de 1 a 2 millones de plaquetas purificadas en hasta 100 μL de tampón de tinción y 0,4 mM de péptido GPRP. Añadir trombina para activar las plaquetas y teñir las células siguiendo el paso 2.2.
nota: Se debe agregar GPRP a la muestra antes de agregar trombina para evitar la formación de agregados o coágulos a través de la activación de las plaquetas. La concentración de trombina debe optimizarse para obtener una buena activación de las plaquetas. Después de la activación de las plaquetas, los recuentos de eventos disminuyen durante la adquisición de muestras por citometría de flujo.
- Como control positivo, agregue 1 μL de sangre entera en hasta 100 μL de tampón de tinción en un tubo y 0,4 mM de péptido GPRP. Añadir trombina para activar las plaquetas. Como control negativo, añadir 1 μL de sangre entera en hasta 100 μL de tampón de tinción. No agregue trombina a la muestra de control negativa. Tiñe las células siguiendo el paso 2.2.
- Para el control del isotipo por citometría de flujo, etiquete 5 tubos con PE-Cy7, PE, FITC y APC sin teñir. Agregue 100 μL de tampón de tinción, 1 μL de sangre y 1 μL del anticuerpo respectivo a los tubos marcados para teñir las células.
- Incubar las muestras para teñirlas durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lave las muestras añadiendo 1 ml de tampón de tinción a cada tubo. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el tampón de tinción con cuidado sin desalojar el pellet.
- Agregue 300 μL de tampón de tinción a cada tubo, mezcle ligeramente y transfiera a un tubo FACS. Guarde las muestras teñidas en la oscuridad hasta que se analicen con un citómetro de flujo.
