Purificación y Activación de Plaquetas a partir de Sangre Entera Murina

Resumen

Fuente: Narciso, M. G., et al. Purificación de plaquetas a partir de sangre de ratón. J. Vis. Exp. (2019).

En este vídeo, describimos un protocolo para purificar plaquetas de sangre total murina y su posterior activación con el agonista plaquetario trombina. Cuando se analizan con citometría de flujo, las plaquetas en reposo purificadas se caracterizan en función de la expresión de su marcador de superficie celular CD41, mientras que las plaquetas activadas purificadas coexpresan los marcadores de superficie CD41 y CD62P.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Purificación de plaquetas

NOTA: La purificación de las plaquetas debe realizarse a temperatura ambiente para evitar su degradación. Asegúrese de que la temperatura de los reactivos e instrumentos esté entre 18 y 22 °C. Para prevenir la degradación de las plaquetas, se debe evitar el pipeteo rápido y la agitación vigorosa durante el procedimiento.

1. Añadir 600 μL de medio de gradiente de iohexo....

Resultados

Figura 1. Sangre de ratón antes y después de la centrifugación con medio de gradiente Iohexol. (A) El iohexol y la sangre forman dos capas separadas antes de la centrifugación si la muestra de sangre se agrega con cuidado. El panel izquierdo muestra el diagrama esquemático y el panel derecho muestra la imagen real. (B) Se observan cuatro capas separadas después de la centrifugación de sangre complet.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
APC rata anti-ratón/humano CD62P (P-selectin)	Termocientífico	17-0626-82	Marcador de activación de plaquetas
Tubo de Eppendorf	Fisher Científico	14-222-166	Tubo para centrífuga
Suero fetal bovino (FBS)	Invitrogen	26140079	Ingrediente para el tampón de tinción
FITC rata anti-ratón CD41	BD Biociencias	553848	Marcador de plaquetas
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)	EMD Millipore	03-34-0001	Prevenir la formación de coágulos plaquetarios
Puntas de pipeta de 1000 μL, de diámetro ancho	ThermoFisher Scientific	21-236-2C	Transferencia de muestras de sangre y plaquetas
Rata PE anti-ratón CD45	BD Biociencias	561087	Marcador de leucocitos
PE-Cy7 anti-ratón para ratas TER 119	BD Biociencias	557853	Marcador RBC
Puntas de pipeta de 200 μL, de diámetro ancho	ThermoFisher Scientific	21-236-1A	Transferencia de muestras de sangre y plaquetas
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientific	14040-117	Tampón para lavado y dilución
Tampón de tinción	interno	Artículo fuera del catálogo	Tampón de lavado y dilución
trombina	Laboratorio de Investigación Enzimática	HT 1002a	Agonista de la activación plaquetaria
cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S7653	Solución salina fisiológica
Centrífuga de sobremesa	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	Centrífuga de rotor de cangilón oscilante
Tricina	Sigma-Aldrich	T0377	Tampón para Nycodenz medium
Tubo FACS	Fisher Científico	352008	Tubos para citometría de flujo