Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de medios, soluciones enzimáticas y animales
- Prepare alcohol yodado al 1% disolviendo 1 g de yodo en 100 ml de etanol.
- Prepare 2 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco sin Ca2+ y Mg2+ suplementados cada uno con 7,5 ml de D-glucosa (100 g/L) y 5 ml de solución madre de penicilina/estreptomicina 100x (15 mg/ml de D-glucosa, 50 U/ml de penicilina y 50 μg/ml de estreptomicina final).
- Complemente 1 medio de 500 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 5 ml de solución madre de penicilina/estreptomicina 100x (50 U/ml de penicilina y 50 μg/ml de estreptomicina final).
- Prepare una solución de tripsina-DNasa I (2,5 mg/ml de tripsina y 10 μg/ml de DNasa I) añadiendo 25 mg de tripsina y 0,1 ml de DNasa I (1 mg/ml de DNasa I) a 9,9 ml de PBS.
- Disolver 50 mg de inhibidor de tripsina en 5 ml de PBS para solución de inhibidor de tripsina A (10 mg/ml). Disolver 25 mg de inhibidor de tripsina en 10 ml de PBS para solución de inhibidor de tripsina B (2,5 mg/ml).
- Para una solución de colagenasa-hialuronidasa-desoxirribonucleasa I (DNasa I), disuelva 10 mg de colagenasa A (1 mg/ml final), 10 mg de hialuronidasa (1 mg/ml final) y 0,1 ml de DNasa I (1 mg/ml de DNasa I) (10 μg/ml final) en 10 ml de PBS.
- Prepare una solución de hialuronidasa-DNasa I añadiendo 10 mg de hialuronidasa (1 mg/ml final) y 0,1 ml de solución de DNasa I (1 mg/ml) (10 μg/ml final) a 9,9 ml de PBS.
- Ordene las ratas Wistar a tiempo para que tengan 19 días de edad el día del aislamiento de la celda de Sertoli.
nota: El protocolo descrito está diseñado para 10 ratas, pero puede modificarse para un mínimo de 5 y un máximo de 20 ratas. Los volúmenes de todas las soluciones deben ajustarse en consecuencia.
En el siguiente protocolo, una "pipeta" significa una pipeta serológica.
>2. Preparación de túbulos seminíferos
- Anestesiar a 10 ratas Wistar macho una por una en un desecador usando CO2 y un caudal que desplace al menos el 20% del volumen de la cámara por minuto. Espere hasta que se detenga la respiración, pruebe la anestesia apretando una almohadilla para los pies y, si no hay reacción, eutanasique a cada rata mediante la dislocación cervical. Drene la sangre seccionando la vena yugular y la arteria carótida (vagina carótida) bajo corriente de agua. Desinfecte el abdomen limpiándolo con etanol al 70%.
- Con fórceps, levante la piel de los músculos abdominales y corte un lóbulo de piel de forma ovalada que se extiende desde la sínfisis púbica hasta el esternón (Figura 1A) y coléelo hacia arriba sobre el pecho. A continuación, agarra los músculos abdominales y haz una incisión medial desde la sínfisis púbica hasta el esternón.
- Aprieta el abdomen con los pulgares desde la pelvis hacia arriba para empujar los testículos fuera de la pelvis inferior. Tome la almohadilla de grasa del epidídimo (Figura 1B) con pinzas para levantar más el testículo. Cortar el cordón espermático (Figura 1B), dejando intacta la túnica albugínea, y recoger todos los testículos en 20 ml de PBS en un tubo cónico de 50 ml (Figura 1C).
- Después de recolectar todos los testículos, desinféctelos agregando un volumen igual (20 ml) de yodo al 1% (p/v) en etanol. Invierta el tubo dos veces y decante el sobrenadante inmediatamente. Lave rápidamente los testículos dos veces con 25 ml de PBS cada uno (Figura 1D).
- Transfiera los testículos a una placa de Petri que contenga 15 ml de PBS (Figura 1E). Agarre cada testículo firmemente con pinzas en un extremo, haga una pequeña incisión en la túnica albugínea en el extremo opuesto y exprima los túbulos con hojas de tijera cerradas como herramienta >nota: Los túbulos aún deben formar un haz compacto en forma de testículo con solo unos pocos túbulos que se extienden en la solución para permitir una digestión enzimática homogénea (Figura 1F).
- Transfiera los testículos desencapsulados a un frasco con tapón de rosca de 100 ml que contenga 10 ml de solución de tripsina-DNasa I. Realizar la digestión en un baño de agua agitada a 32 °C (120 oscilaciones/min). Después de 4 minutos, evalúe los túbulos a simple vista para detectar la dispersión de los túbulos. Una vez que los túbulos comiencen a dispersarse en la solución, detenga la digestión inmediatamente. Si es necesario, continúe la incubación durante un máximo de 2 minutos.
- Detenga la digestión de la tripsina añadiendo 5 ml de solución de inhibidor de tripsina A. Mezcle bien la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3-4 veces con una pipeta de 10 ml y transfiérala a un tubo cónico de 50 ml.
- Después de 5 min de incubación, observe cómo los túbulos se asientan por unidad de gravedad, retire cuidadosamente el sobrenadante utilizando la pipeta de 10 ml del paso 2.6 y agregue 10 ml de solución de inhibidor de tripsina B para detener completamente la digestión de la tripsina. Vuelva a suspender los túbulos pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces.
- Para eliminar las células intersticiales contaminantes, lavar los túbulos 9 veces con 25 ml de PBS cada uno. Vuelva a suspender los túbulos en cada lavado con una pipeta de 25 ml y deje que se asienten por unidad de gravedad durante 10 min. Utilice siempre la misma pipeta de 25 ml para pipetear el PBS, la resuspensión y la extracción del sobrenadante.
>3. Extracción/aislamiento de células peritubulares (PTC)
- Transfiera todos los túbulos a un frasco de rosca de 100 ml y agregue la solución de colagenasa-hialuronidasa-DNasa I (Figura 2A). Realizar la digestión durante 10 min en un baño de agua agitada a 32 °C (120 oscilaciones/min).
- Pipetear una gota de la suspensión en un portaobjetos de vidrio y examinar rápidamente los túbulos bajo un microscopio de luz invertida para el cultivo celular de rutina con un aumento de 100x. Si la digestión no está lo suficientemente avanzada, continúe la incubación durante 2 minutos adicionales (no cuente el tiempo necesario para el control microscópico).
nota: Durante este paso, todos los túbulos se acortan en longitud y los bordes de los túbulos deben volverse ásperos (Figura 2B y C). Los bordes ásperos son indicativos de la liberación de células peritubulares.
- Transfiera la suspensión con los túbulos digeridos a un tubo cónico de 50 ml utilizando la pipeta de 25 ml del paso 2.8. Lave el frasco de 100 ml con 10 ml de PBS y añádalo a los túbulos del tubo cónico. Deje que los túbulos digeridos se asienten por unidad de gravedad durante 10 minutos, y aspire cuidadosamente el sobrenadante, que contiene las PTC, utilizando de nuevo la pipeta de 25 ml, y transfiéralo a un nuevo tubo cónico. Para la aspiración de los últimos mililitros, utilice una pipeta de 5 ml para evitar cualquier arrastre de túbulos.
>4. Aislamiento de células de Sertoli (SCs)
- Vuelva a suspender los túbulos sedimentados del paso 3.3 a fondo en 25 ml de PBS utilizando una pipeta de 25 ml y deje que se asienten por unidad de gravedad durante 12 min. Utilice la misma pipeta de 25 ml para pipetear PBS, resuspender los túbulos y eliminar los sobrenadantes. Repita el lavado 3 veces (4 lavados en total).
- Después del último lavado, transfiera los túbulos digeridos a otro frasco de rosca de 100 ml que contenga la solución de hialuronidasa-DNasa I. Realizar la digestión en un baño de agua agitada a 32 °C (120 oscilaciones/min).
- Después de 5 minutos, vuelva a comprobar los túbulos mediante una inspección microscópica con un aumento de 100X, como se describe en el paso 3.2.
nota: Los túbulos cortos, los agregados tubulares y las células liberadas deben ser visibles (Figura 2D).
- Dejar reposar los agregados tubulares durante 10 min y aspirar el sobrenadante con una pipeta de 25 ml. Lave los agregados 4 veces con 25 ml de PBS y un tiempo de sedimentación de 10 min para cada paso de lavado (Figura 2E).
- Añadir 20 ml de RPMI 1640 medium y pasar la suspensión 10 veces a través de una aguja de 18 G montada en una jeringa de 20 ml. Evite las burbujas de aire.
nota: Tirar de la suspensión hacia adentro y hacia afuera a través de la aguja se considera como una sola pasada. La disrupción y homogeneización de células por cizallamiento hidrodinámico es una técnica estándar en la preparación de células que tienden a agregarse. Es poco probable que el paso de las células a través de una aguja hipodérmica de diámetro interior pequeño tenga un impacto en sus propiedades funcionales. Las figuras 3C y D muestran la ultraestructura normal de las células de Sertoli purificadas en el día 4 de cultivo.
- Pipetear una gota de la suspensión en un portaobjetos de vidrio y revisar rápidamente los túbulos bajo un microscopio de luz invertida para el cultivo celular de rutina con un aumento de 10X si los agregados están todos dispersos (Figura 2F). Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm para obtener una suspensión unicelular pura en el filtrado.
- Centrifugar el filtrado del paso 4.4 a 200 x g durante 10 min en RT sin utilizar el descanso. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de 25 ml y volver a suspender las células de Sertoli en un medio RPMI 1640 de 40 ml (sin suero).
- Mezcle 100 μl de suspensión de células con 100 μl de tinción de azul de tripán y cuente las células con una cámara Neubauer Enhanced. Ajuste la concentración de células a 3 x 106 células/ml según el resultado del recuento. Siembre 1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos (=día 1). nota: Las células de Sertoli en suspensión se sedimentan rápidamente, por lo que el tubo debe agitarse brevemente cada vez antes de tomar una alícuota celular con la pipeta. Hasta el día 4 se adhieren firmemente al sustrato.
