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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Aislamiento de células T Vδ1
- Tome <1 x 106 linfocitos aislados para un FACS inicial que determine la frecuencia de linfocitos T CD4 Vδ1.
nota: El tamaño de la población de esta entidad de células T puede diferir mucho entre individuos y según su estado inmunológico. Por lo general, alrededor del 1% de las células T son Vδ1+ y alrededor del 1-5% de las células Vδ1+ son CD4+.
- Diluya las células con 1 ml de tampón FACS, que consiste en PBS que contiene un 2% de FCS y 5 mM de EDTA. Centrifugar a 660 x g durante 2 min y decantar el sobrenadante. El volumen de reflujo de unos 100 μl de tampón FACS es suficiente para la tinción posterior. Agitar brevemente e incubar las células con 5 μl de reactivo bloqueante Fc durante 5 min en RT para aumentar la especificidad de la tinción con FACS.
- Agregue anticuerpos monoclonales humanos directamente a las células sin eliminar el reactivo de bloqueo Fc. Asegúrese de teñir las células con anticuerpos contra Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1:200), CD8 (1:200) y TCRαβ (1:25). Preparar el control de isotipos con los isotipos de inmunoglobulinas correspondientes. Incubar las células con anticuerpos durante 20 min a 4 °C en la oscuridad.
- Lavar las células en 1 ml de tampón FACS (centrifugar durante 2 min; a 660 x g), decantar el sobrenadante y proceder a la adquisición de FACS en el volumen de tampón restante.
- Peletizar las células (que no se utilizan en el análisis FACS) por centrifugación durante 12 min; a 300 g; 8 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspender la célula en 60 μl de tampón MACS por 1 x 107 células. Añadir 20 μl de reactivo bloqueante de FC por 1 x 107 células e incubar durante 5 min a 4 °C.
- Añadir 10 μl de anticuerpo Vδ1 humano conjugado con FITC por cada 1 x 107 células directamente a las células. Incubar durante 12 min a 4 °C en la oscuridad.
- Lavar las células con 14 ml de tampón MACS (centrifugar durante 12 min; a 300 g; 8 °C). Deseche el sobrenadante por completo y vuelva a suspender las células en un tampón MACS de 80 μl por 1x107 células.
- Tomar 1-2 x 105 células y diluirlas en 100 μl de tampón FACS para verificar el etiquetado mediante análisis FACS. No se necesitan más aditivos para este paso. Asegúrese de que haya una diferencia suficiente en el brillo de las celdas Vδ1- y Vδ1+. Si este no es el caso, repita los pasos 1.3 y 1.4.
- Añadir 20 μl de microperlas anti-FITC por 1 x 107 células a las células restantes, mezclar bien e incubar durante 15 min en la oscuridad a 4 °C. A continuación, lavar las células con al menos 10 ml de tampón MACS (centrifugar durante 12 min, a 300 x g; 8 °C).
- Durante la centrifugación, equilibre la columna magnética preenfriada colocada en un imán con tampón MACS de 500 μl.
- Vuelva a suspender las células en un tampón MACS de 500 μl (para números de células superiores a 1 x 108, aumente este volumen en consecuencia) y aplique las células con cuidado sobre la columna. Recoja el flujo continuo que contiene las celdas Vδ1-.
- Lave la columna tres veces con tampón MACS de 500 μl y recoja el flujo de nuevo en el mismo tubo. Tenga en cuenta que el depósito debe estar vacío antes de aplicar el búfer en la columna.
- Retire la columna del dispositivo magnético y colóquela en un tubo cónico de 15 ml. Enjuague rápidamente la columna con 1 ml de tampón MACS empujando firmemente el émbolo en la columna. Recoja el eluido en un tubo.
NOTA: Para obtener una pureza del >98%, generalmente es necesario repetir los pasos 1.7-1.9 con una segunda columna.
- Verificar la pureza de las células mediante un análisis FACS con el mismo panel de anticuerpos que antes (ver 1.1.2) y contar las células.
>2. Aislamiento de células T Vδ1CD4+
- Vuelva a suspender 25 μl de perlas de CD4 con un vórtice durante >30 seg. Lave las perlas (la cantidad mínima indicada por el fabricante) en 1 ml de tampón MACS en un tubo de reacción de 1,5 ml colocando el tubo en un imán durante 1 min. Deseche el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta pequeña (200 μl) y vuelva a suspender las perlas en el volumen original de tampón MACS.
- Peletizar las células Vδ1+ (centrífugas durante 12 min; a 300 x g) y aspirar el sobrenadante y resuspender todas las células Vδ1+ en 500 μl de tampón MACS y añadirlas al tubo que contiene las perlas. Mezclar vigorosamente e incubar durante 20 min a 4 °C con inclinación constante (por ejemplo, en un rotador).
- Coloque el tubo que contiene las células en un imán durante 2 min. Asegúrese de que no queden restos en la tapa.
NOTA: Las pilas CD4+ habrán unido las perlas magnéticas y se unirán al lado del tubo que mira hacia el imán.
- Abra con cuidado la tapa mientras mantiene el tubo dentro del dispositivo magnético y recoja el sobrenadante que contiene las células CD4-Vδ1+ con una pipeta a pequeña escala. Coloque las células CD4-Vδ1+ en un tubo separado y vuelva a colocar este tubo en el imán para evitar la posibilidad de que queden células CD4 o perlas de la población.
- Lave las células CD4- en 5 ml de tampón MACS (centrífuga durante 12 min; a 300 x g) y vuelva a suspenderlas en una concentración de 1 x 105 células por 100 μl de medio. Las células CD4 se pueden cultivar fácilmente en condiciones adecuadas.
- Coloque el tubo con los objetivos de las células CD4+ fuera del campo magnético, vuelva a suspender las células en un tampón MACS de 500 μl y vuelva a colocarlas en el dispositivo magnético. Repita los pasos 2.3-2.5 dos veces para obtener una mayor pureza. Eliminar el sobrenadante mediante pipeteo.
- Vuelva a suspender las células CD4+ en un medio de cultivo de 100 μl (RPMI 1640, 10 % FCS, 1 % L-glutamina, 1 % de penicilina/estreptomicina) y agregue 10 μl de una solución que desprenda perlas. Incubar en RT durante 45 min con inclinación constante (por ejemplo, en un rotador).
- Coloque las células en un imán durante 1 min. Recoja cuidadosamente el sobrenadante que contiene células Vδ1+CD4+ sin perlas con una pipeta a pequeña escala.
- Fuera del imán, vuelva a suspender las perlas con un medio de cultivo de 100 μl y repita los pasos 2.6 y 2.7 dos veces para obtener un mayor número de células CD4+.
- Peletizar las células (centrifugar a 300 x g, durante 12 min) y desechar completamente el sobrenadante mediante pipeteo. Vuelva a suspender las células en medios frescos y precalentados y cuéntelas. Examine la pureza de las células Vδ1+CD4+ mediante el análisis FACS descrito en los pasos 1.1.1-1.1.3.