Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Generación de NETs
- Estimular los neutrófilos con 500 nM de PMA (por 30 ml de solución de neutrófilos) e incubar en una placa de cultivo de tejido plano de 150 x 25 mm con una rejilla de 20 mm durante 4 horas a 37 °C 5% CO2. Esto permitirá NETosis.
- Después de 4 horas de estimulación, aspire suavemente y deseche el medio, dejando la capa de NET y neutrófilos adherida en la parte inferior. No altere esta capa.
- Utilizando un total de 15 ml de PBS frío sin Ca y Mg por plato, lave el fondo de cada plato pipeteando 15 ml de PBS en el fondo del plato para eliminar todo el material adherente del fondo.
- Recoja la solución obtenida del lavado de cada plato (paso 1.3) en un tubo cónico de 15 ml y centrifugue durante 10 min a 450 x g a 4 °C. Los neutrófilos y las células restantes se desprenderán en el fondo, dejando un sobrenadante rico en NET libre de células.
- Divida el sobrenadante en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifuga durante 10 min a 18.000 x g a 4 °C. Esto permitirá que todo el ADN se granule.
nota: La centrifugación en tubos más grandes es más fácil y requiere menos tiempo si se pueden alcanzar velocidades tan altas en la centrífuga normal, de lo contrario, será necesario dividir los sobrenadantes en tubos más pequeños para usar una microcentrífuga de alta velocidad.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender todos los gránulos obtenidos juntos en PBS helado a una concentración correspondiente a 2 x 107 neutrófilos por 100 μl de PBS. Esto producirá el stock NET libre de celdas que se puede utilizar para experimentos posteriores.
- Mida la concentración de ADN en la muestra obtenida mediante espectrofotometría o una herramienta alternativa de cuantificación de ADN. Una concentración adecuada en la muestra debe oscilar entre 140 y 180 ng/μl.
