Aislamiento de la red de células inmunitarias gingivales de bloques dentales murinos

Resumen

Fuente: Dutzan, N. et al., Aislamiento, caracterización y examen funcional de la red de células inmunitarias gingivales. J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra el procedimiento de aislamiento de la red de células inmunes gingivales a partir de un modelo de ratón. La digestión enzimática libera el tejido gingival de los dientes y el hueso adheridos, que se digiere mecánicamente, liberando células inmunitarias de la encía. Las células aisladas están listas para experimentos inmunológicos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Prepárese con anticipación

1. Preparación Medios completos: RPMI suplementado con 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina y 10% de FBS.
2. Preparar medios de DNasa: 50 ml de medios RPMI suplementados con 7,5 μg de DNasa (Hacer fresco, mantener en hielo en todo momento).
3. Prepare el medio de colagenasa-DNasa: 5 ml de medio de DNasa más 3,2 mg/ml de colagenasa tipo IV (Hacer fresco, mantener en hielo en todo momento).
4. Preenfriar la centrífuga a 4 °C.
5. Incubadora agitadora caliente a 37 °C.

>2. Aislamiento, disección y aislamiento celular de bloqueos gingivales

1. Eutanasiar ratones exponiéndolos al CO₂ en una cámara adecuada, de acuerdo con las directrices del Comité Asesor de Investigación Animal (ARAC).
2. Abrir la cavidad torácica y abdominal para exponer el corazón y los órganos internos. Para la perfusión, realizar una incisión en la vena cava inferior y perfundir 3 ml de PBS a través del ventrículo izquierdo con una jeringa de 3 ml con aguja de 27 G.
3. Inmoviliza el cuerpo y la cabeza del ratón en una almohadilla con el estómago hacia arriba.
4. Corta cada comisura del labio hacia el cuello con unas tijeras, separando la piel que cubre la mandíbula y la región del cuello, y exponiendo los tejidos y músculos subyacentes. Disecciona el labio inferior para descubrir la mandíbula.
5. Corte entre los incisivos inferiores para separar ambos lados de la mandíbula e inmovilizar cada lado para acceder a la cavidad oral.
6. Visualice y diseccione el paladar lejos de la cavidad nasal.
7. Diseccione las áreas con una hoja de 10 e incluya las áreas de los molares maxilares y mandibulares con la encía circundante (Figura 1). Haga incisiones verticales justo antes del primer molar y posteriores al tercer molar y una incisión horizontal en el borde de la encía (cuello blanco de tejido que rodea los dientes).
8. Coloque los bloques maxilar y mandibular en un tubo cónico de 50 ml con 5 ml de colagenasa/DNasa (mantener en hielo).
9. Incubar en una incubadora agitadora a 37 °C durante 1 hora y durante los últimos 5 min de incubación añadir 50 μl de EDTA 0,5 M.
10. Agregue 5 ml de medios de DNasa fríos al tubo de 50 ml con pañuelos desechables y agite suavemente para mezclar.
11. Transfiera los 4 bloques de tejido a una placa de Petri y cúbralos con 500 μl de medio DNasa. Extraiga la encía de cada bloque de tejido, utilizando una hoja de bisturí y apuntando la hoja hacia las áreas gingivales e interdentales.
12. Transfiera los tejidos y los medios de la placa de Petri, así como los medios de DNasa utilizados anteriormente durante la disección, a un nuevo tubo de 50 ml a través del filtro de células (tamaño de 70 μm). Lavar con DNase (3-5 ml) todos los instrumentos utilizados y filtrar.
13. Con el émbolo de una jeringa estéril de 3 ml, triture el tejido contra el colador, filtrando con medios de DNasa fríos (30 a 35 ml).
14. Lave el filtro de células con medios de DNasa fríos.
15. Centrifugar a 4 °C, 314 x g durante 6 min.
16. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en 1 ml de medio completo.
17. Recuento de celdas (la cantidad esperada debe oscilar entre 8 x 10⁵ y 1,2 x 10⁶ celdas con una viabilidad del >80%) utilizando un contador de celdas automatizado.

Resultados

Figura 1: Aislamiento de encía murina. Ilustración que muestra los bordes de la disección en el maxilar y el segmento gingival aislado que se utilizará para la disección de tejido gingival. (B) Segmento del maxilar murino (área molar) con un contorno para la disección en bloque y bloqueo aislado. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de un segmento molar maxilar con tejidos gingivales delineados se muestra en bajo (C) y mayo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tijeras finas	Herramientas de alta ciencia	14058-11
Mango de bisturí #3	Herramientas de alta ciencia	10003-12
Hojas de bisturí #10	Herramientas de alta ciencia	10010-00	estéril
Pinzas para astillas	Integra Miltex	6-304
Agujas con bisel regular	BD Médico	305109	27 G, 12,7 mm de longitud
Jeringas monoyectas	Covidien	8881513934	Punta Luer-lock, 3mL
PBS, pH 7.4	Tecnologías de la Vida	10010-049	Sin calcio y magnesio
RPMI 1640	Lonza	12-167F	Sin L-glutamina
DNasa I de páncreas bovino	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Colagenasa tipo IV	Gibco (por Life technologies)	17104-019
Suero Fetal Bovino	Bioproductos Gemini	De los 100 a 106
Gentamicina 50 mg/ml	Calidad biológica	120-098-661EA
Estreptococo de la pluma	Gibco (por Life technologies)	Números 15140-122
L-Glutamina	Gibco (por Life technologies)	25030-081
0.5M EDTA pH 8.0	Calidad biológica	351-027-721EA
Tubos de 50 mL	Corning	352070	Polipropileno, estéril
Filtros de células de 70 μM	Corning	352350
Placas de Petri	Corning	351029	estéril

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