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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Muestras de tejido pulmonar
NOTA: Para estudios in vivo de tejido pulmonar, estudie las muestras después de la exposición correspondiente. La exposición más relevante para este experimento son los microorganismos infecciosos, en particular las bacterias. Las cepas de ratón que podrían utilizarse para este método son ratones C57BL/6 o BALB/c, de 10 a 12 semanas de edad, peso de 25 a 30 g y machos.
- Eutanasia de ratones, mediante una inyección intraperitoneal de ketamina (400 mg/kg) y xilacina (40 mg/kg). Abra la cavidad torácica y exponga los pulmones y el corazón con pinzas quirúrgicas y tijeras.
- Infundir PBS caliente con una aguja de calibre 21 en el ventrículo derecho para lavar la sangre de los vasos durante 30 s, luego infundir 10 mL de fijador de PLP al 2% durante 30 s (en el ventrículo derecho).
- Utilice PBS tibio (42 °C) para lavar la cavidad torácica abierta. Intuble la tráquea con una aguja de calibre 21 y un trozo de tubo de 0,8 mm cortado a medida, e inyecte 800 μL de solución de agarosa al 3% precalentada (a 42 °C) y de bajo punto de fusión.
- Ata la tráquea con seda trenzada (4.0 USP). Coloque el hilo alrededor de la tráquea, justo debajo del punto de inserción de la cánula, y asegúrelo con un simple nudo simple. Para solidificar la agarosa, administre PBS helado alrededor de los pulmones. Extirpe los pulmones y el corazón como un bloque de la cavidad torácica utilizando tijeras y disección roma. Retire cada pulmón individualmente y luego fíjelos durante 16 h en PLP al 2% o formol a 4 °C.
- Almacene las muestras en PBS a 4 °C hasta el corte del tejido.
- Para preparar las muestras de tejido pulmonar, siga estos pasos.
- Fijar los tejidos pulmonares (resecados en el paso 1.1) en formol tamponado al 10% natural durante 24 h a temperatura ambiente. Transfiera a etanol al 75% y colóquelo en un procesador de tejidos en un ciclo de 12 h (2,5 h en EtOH al 75%, 3 h en EtOH absoluto, 3,5 h en solvente 3B y 3 h en parafina).
- Incruste en parafina estándar para crear bloques fijados en formol e incrustados en parafina (FFPE) que se almacenan a temperatura ambiente.
nota: En esta etapa, generalmente es conveniente cortar las secciones pulmonares para portaobjetos estándar.
- Corte las secciones pulmonares de FFPE de 4 a 5 μm de grosor con un micrótomo y móntelas en portaobjetos cargados y recubiertos.
- Para montar las guías, coloque 3 gotas de medio de montaje en cubreobjetos de 60 mm x 24 mm (tamaño 1,5), invierta la corredera en el cubreobjetos y expulse el exceso de medio. Séllalos herméticamente con esmalte de uñas y guárdalos a temperatura ambiente.
>2. Preparación/Microscopía de Muestras de Tejido Pulmonar
- Para desparafinar, rehidratar y pretratar la muestra de tejido pulmonar FFPE con una solución de recuperación de antígenos.
- Secar los portaobjetos FFPE durante 60 minutos a 60 °C. A continuación, coloque los portaobjetos en una solución de xileno durante 30 minutos y transfiéralos a una solución de etanol al 70% durante 5 minutos a temperatura ambiente. Enjuague con agua del grifo.
- Coloque en una envoltura de plástico resistente al calor y sujete a recuperación de antígeno HIER en una olla a presión durante 10 min en 10 m / mol / L Tris, 1 mmol / EDTA pH 9.0. Deja enfriar durante 20 min. Lave dos veces en agua del grifo durante 5 minutos en una mecedora, luego una vez con PBS en una mecedora.
- Bloquee con 10% de suero de pollo en 5% BSA/PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
- Tiñe el tejido.
- Para definir los MET en los macrófagos, añada anticuerpos primarios (MMP-9, H3Cit y F4/80) en BSA/PBS al 1% durante 16 h a 4 °C con una dilución de 1/100 (los detalles específicos sobre las cantidades de anticuerpos se enumeran en la Tabla de materiales). Lavar dos veces con PBS durante 5 minutos en una mecedora.
- Logre la detección fluorescente por incubación con los anticuerpos secundarios correspondientes en BSA/PBS al 1% durante 40 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos son: (1) pollo anti-ratón 488 (verde), (2) pollo anti-cabra 594 (rojo) y (3) burro anti-ratón 647 (rojo lejano).
- Lave las secciones en PBS y móntelas con un medio de montaje que contenga DAPI para la tinción de cromatina.
- Obtenga imágenes fluorescentes utilizando un cabezal de escaneo láser confocal conectado a un microscopio invertido.
- Excite la preparación con láseres de 405, 488, 561 y 647 nm. Capture imágenes de un solo plano de 512 x 512 píxeles haciendo clic en el botón de nivelación secuencial de línea (promedio de 2 líneas) con objetivos de aire 20X 0.1 NA y 40X 1.0 NA aceite.
- Obtenga al menos diez campos de visión por sección para el análisis y los datos para cada resultado (es decir, 10 campos de visión de alta potencia (VOAF) para el control, 10 para la muestra estimulada, etc., para cada ratón)
nota: Para obtener una muestra representativa de todo el campo, se puede utilizar un sistema de matrices en el que el campo se divide en diferentes secciones, y para cada muestra diferente se utiliza la misma matriz para seleccionar los campos de visión (por ejemplo, el campo se puede dividir en 9 secciones, y desde el centro y las 4 esquinas, se toman dos VOAF).