Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
NOTA: En la Figura 1 se describe un flujo esquemático del método.
1. Preparación del material
NOTA: Prepare todos los reactivos asépticamente en una campana estéril, y alícuota y almacene a la temperatura indicada. Los reactivos se pueden almacenar hasta 2 años sin perder su efecto.
- Prepare CFA que contenga 20 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis como se describe a continuación.
- Añadir 100 mg de M. tuberculosis H37RA liofilizado (ver Tabla de Materiales) y cinco perlas de acero de 3,2 mm a un tubo de 7 mL (ver Tabla de Materiales). Agite el tubo en un homogeneizador (consulte la tabla de materiales) durante 60 s al ajuste de velocidad más alto (5.000 rpm).
- Añada 5 ml de adyuvante de Freund incompleto (IFA) al tubo y agite de nuevo durante 60 s a la velocidad más alta. Transfiera la suspensión de M. tuberculosis homogeneizada en IFA (ahora llamada CFA) a un tubo nuevo con una pipeta, dejando las perlas, y almacene a 4 °C hasta su uso.
- Añada agua ultrapura al polvo liofilizado del péptido MOG35-55 (véase la Tabla de materiales) para obtener una concentración final de péptido de 10 mg/mL. Esterilice la solución pasándola a través de un filtro de 0,2 μm. Prepare 60 μL de alícuotas y almacene a -20 °C hasta su uso.
nota: El péptido MOG35-55 utilizado para este experimento es de pureza ImmunoGrade (~70%), está escindido en TFA, se disuelve fácilmente en agua y contiene una amida C-terminal (-NH2) para aumentar la estabilidad in vivo. Las alícuotas peptídicas nunca se descongelaron y se volvieron a congelar más de dos veces, y se almacenaron a -20 °C hasta su uso.
>2. Preparación de emulsiones de CFA/péptidos
- Calcule la cantidad de emulsión necesaria para la inmunización. En este protocolo estándar, cada ratón recibe 50 μg de péptido MOG35-55 y 300 μg de M. tuberculosis dispersos en el adyuvante de Freund (CFA). La cantidad de cada reactivo (péptido MOG35-55, PBS, CFA e IFA) necesaria para preparar las emulsiones se puede calcular utilizando el archivo complementario 1. Un 20% adicional de todos los reactivos, para compensar la pequeña pérdida de emulsión, se incluye en el cálculo.
nota: El kit de emulsión comercial (ver Tabla de Materiales) utilizado en este estudio comprende un tubo, un tapón de rosca y un émbolo en una bolsa esterilizada. Cada tubo del kit de emulsión contiene un máximo de 9,6 mL, lo que permite preparar 8 jeringas de 1 mL suficientes para inmunizar a 40 ratones (o 80 ratones si se utilizan 100 μL de emulsión por animal).
- Coloque el tubo con tapón de rosca (del kit de emulsión comercial) y los reactivos que se utilizarán en hielo.
- Agregue los componentes de la emulsión en el siguiente orden en los volúmenes calculados en el paso 2.1: PBS, luego el péptido, luego M. tuberculosis en CFA y finalmente IFA.
- Cierre el tubo con la tapa firmemente apretándola y aflojándola varias veces. Agite el tubo vigorosamente durante 5-10 s con la mano para premezclar los reactivos.
- Coloque el tubo en el homogeneizador de agitación y asegúrelo con la varilla. Ajuste la velocidad al ajuste más alto y el tiempo a 60 s. Una vez finalizada la carrera, coloca el tubo en hielo durante 3 min. Repita la ejecución una o dos veces más con la misma configuración.
- Centrifugar el tubo a 300 x g durante 1 min para eliminar el aire atrapado y compactar la emulsión.
- Retire la tapa del tubo, inserte el émbolo en el tubo y empújelo lentamente hasta que llegue a la parte superior de la emulsión. Retire el cierre a presión en la parte inferior del tubo girándolo.
- Retire el émbolo de una jeringa inyectable (1 mL; consulte la Tabla de materiales). Añada una aguja (preferiblemente de 25-27 G) a la jeringa inyectable.
- Conecte el extremo posterior de la jeringa de inyección al bloqueo dedicado en la parte inferior del tubo y bloquéelo con un giro corto.
- Transfiera la emulsión del tubo a la jeringa de inyección empujando suavemente el émbolo. Deténgase cuando la emulsión alcance la graduación de 0,15 mL de la jeringa de inyección.
- Separe la jeringa de inyección del tubo e inserte el émbolo con cuidado, teniendo cuidado de que no entre aire en la jeringa. Empuje el émbolo hasta que la emulsión salga de la aguja.
nota: En este punto, parte de la emulsión se puede utilizar para el control de calidad (consulte el paso 3).
- Repita los pasos 2.8-2.11 para el resto de la emulsión presente en el tubo.
nota: Para minimizar el desperdicio de costosas emulsiones de CFA/antígenos, se deben usar jeringas de 1 mL. Se pueden usar otras jeringas que se ajusten a la cerradura dedicada en la parte inferior del tubo; sin embargo, es posible que sea necesario preparar un volumen mayor de emulsión. La emulsión peptídica CFA/MOG35-55 puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 15 semanas sin perder su capacidad inductora de EAE.
>3. Control de calidad de la emulsión
- Prueba de gota: Añadir una pequeña gota de la emulsión en un tubo cónico estéril de 50 mL lleno de 20 mL de agua fría. Cierra el tubo y agítalo con la mano durante un par de segundos. La aparición de pequeñas gotas distintas confirma la formación de una emulsión de agua en aceite.
- Examine la emulsión con microscopía de contraste de fase.
- Para analizar el tamaño de las partículas de agua en aceite, agregue una pequeña gota (2-3 μL) de la emulsión a un portaobjetos de microscopio, úntelo con un cubreobjetos y luego empuje con fuerza con un movimiento circular para aplanar la emulsión.
- Examine la emulsión untada bajo un microscopio de contraste de fase (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de 400x y concéntrese en un campo con una monocapa de la emulsión. Asegúrese de que se vean pequeñas partículas grises/blancas uniformes (Figura 2A).
