Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación del ratón
NOTA: El siguiente procedimiento, incluyendo la preparación del animal y la cirugía, durará entre 30 y 40 min. Antes de la cirugía, encienda el microscopio y caliente la incubadora adjunta en el microscopio a 37 °C.
- Realizar experimentos en ratones TcrdEGFP de 8 a 10 semanas de edad sobre un fondo C57BL/6, que se obtuvieron de Bernard Malissen (INSERM, París, Francia). De acuerdo con el procedimiento aprobado por la IACUC, anestesiar al ratón mediante inyección i.p. de ketamina (120 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) en función del peso del animal. Evalúe el nivel de anestesia según la frecuencia respiratoria (55-65 respiraciones por minuto), el pellizco de los dedos del pie y el reflejo palpebral.
- Una vez que se alcanza la anestesia quirúrgica, asegure las patas traseras del ratón con cinta adhesiva a una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal, que se puede controlar con un termómetro rectal. Si hay signos de que el efecto de la anestesia está desapareciendo (por ejemplo, aumento de la frecuencia respiratoria, parpadeo y/o espasmos musculares al reflejo palpebral), vuelva a administrar 50 μL de ketamina/xilacina a la vez hasta que el ratón esté completamente sedado.
- Prepare el colorante nuclear diluyendo 50 μL de Hoechst 33342 (10 mg/mL) con 315 μL de solución salina al 0,9%; la concentración final es de 37,5 mg/kg en función del peso del ratón (200 μL de volumen aproximado). Una vez que el ratón esté anestesiado, inyecte lentamente el Hoechst con una jeringa de tuberculina a través del seno venoso retroorbitario.
NOTA: Espere de 1 a 2 minutos antes de continuar con el siguiente paso para permitir que el mouse se aclimate al cambio en el volumen circulante después de la inyección retroorbital.
- Coloque una pequeña cantidad de lubricante sobre los ojos para evitar que se sequen.
>2. Cirugía de ratón: Laparotomía para exponer la mucosa intestinal
- Realizar una incisión vertical de 2 cm a través de la piel y el peritoneo a lo largo de la línea media de la parte inferior del abdomen para exteriorizar la región del intestino que se va a obtener la imagen.
- Con pinzas en ángulo, extraiga con cuidado el ciego de la cavidad peritoneal e identifique el área del intestino delgado que se va a obtener la imagen. Tenga cuidado de no desgarrar los vasos sanguíneos mesentéricos durante este proceso. Para minimizar el daño potencial o el sangrado, evite agarrar o pellizcar el intestino con fórceps.
- Localice una región adecuada del intestino delgado (2-3 cm) para obtener imágenes que contengan un contenido fecal mínimo. Regrese con cuidado el ciego y el intestino delgado restante a la cavidad peritoneal, dejando exteriorizado el segmento de interés.
NOTA: Evite perforar el ciego o alterar la vasculatura mesentérica durante este paso.
- Coloque dos pares de pinzas a cada lado del mesenterio subyacente entre los vasos sanguíneos y frote suavemente las puntas de las pinzas para crear un orificio en la membrana (Figura 1). Esto permitirá que la aguja pase a través del mesenterio al cerrar la cavidad peritoneal debajo del intestino.
- Cierre la incisión manteniendo el asa del intestino exteriorizado. Con ayuda de unas pinzas en ángulo y una aguja curva de punta cónica unida a una sutura de 5 cm, penetre en un lado del peritoneo, atraviese el orificio realizado en el paso anterior y suba por el otro lado del revestimiento peritoneal. Coloque una sutura en la parte superior y otra cerca de la parte inferior de la incisión.
NOTA: Evite dañar la vasculatura durante este paso.
- Repita este proceso para cerrar la piel debajo del asa intestinal, colocando una sutura en el centro de la incisión, entre las suturas anteriores en el peritoneo subyacente.
NOTA: Es importante externalizar solo el área que se va a fotografiar; Esto reducirá el movimiento extraño durante la toma de imágenes. Asegúrese de evitar ligar las arterias mesentéricas.
- Use un electrocauterio para hacer una línea de perforación a lo largo del borde antimesentérico. Inmediatamente después de la cauterización, aplique unas gotas de agua a la superficie del intestino para evitar daños tisulares adicionales inducidos por el calor. Seque con una toallita Kimwipe para eliminar el agua residual.
- Cortar una pequeña hendidura horizontal en el borde distal del tejido cauterizado con unas tijeras Vannas y proceder a cortar a lo largo de la línea cauterizada hacia el extremo proximal del segmento de tejido externalizado (aproximadamente 1,5 cm de longitud) para exponer la superficie mucosa.
NOTA: Si es necesario, use pinzas para eliminar suavemente cualquier exceso de contenido fecal que quede en la superficie mucosa expuesta.
- Cubra el abdomen del ratón con una toallita Kimwipe húmeda para evitar que el tejido se deshidrate. Transporta el ratón al microscopio en un recipiente cubierto.
>3. Adquisición de imágenes mediante microscopía confocal de disco giratorio
- Pipetear 150 μL de 1 μM de AlexaFluor 633 en HBSS sobre la cubierta de vidrio, fondo deslizado de un plato de 35 mm. Coloque el ratón de forma que la superficie mucosa abierta entre en contacto directo con el cubreobjetos.
- Incline la cabeza del microscopio hacia atrás y coloque el ratón en la placa de cubierta en la platina de imágenes en una incubadora precalentada. Alternativamente, cubra el mouse con una manta térmica para mantener la temperatura corporal.
- Inicie el software de creación de imágenes. La intensidad de excitación y el tiempo de exposición de cada láser no deben exceder los 10-15 mW o los 120-150 ms, respectivamente, para evitar el fotoblanqueo y minimizar el intervalo entre puntos de tiempo. Ajuste el promedio de fotogramas a "2" y active la función de ganancia EM para reducir el ruido de fondo. Seleccione la calibración de objetivos de 63x para garantizar la medición correcta del tamaño de píxel.
NOTA: Los ajustes detallados anteriormente están destinados a proporcionar una referencia inicial, pero variarán según las configuraciones individuales del microscopio.
- Usando el láser de 405 nm y el objetivo de aire 20x, visualice los núcleos para localizar un campo de vellosidades que carecen de movimiento perceptible o se desplazan a simple vista. Evite las áreas de movimiento artificial debido a la respiración, el peristaltismo o los latidos del corazón.
- Con el escaneo XY, registre la coordenada XY del campo de interés y cambie al objetivo de inmersión en glicerol 63X.
- Confirme que las vellosidades en el campo seleccionado son estables adquiriendo una imagen en vivo en el canal de 405 nm durante un máximo de 1 minuto.
- Mientras adquiere una imagen en vivo en el canal de 405 nm, ajuste el enfoque para encontrar el plano ortogonal justo debajo de la punta vellosa. Adquiera pilas Z comenzando desde justo debajo del epitelio de la punta vellosa hasta que sea difícil resolver los núcleos, alrededor de 15-20 μm, usando un paso de 1.5 μm.
NOTA: Cuando se toman imágenes con tres canales (405, 488, 640 nm) utilizando los tiempos de exposición descritos anteriormente, es posible adquirir los tres canales secuencialmente a intervalos de aproximadamente 20 s.
- Abra el software en modo de análisis, 3-5 minutos después de comenzar la adquisición, para confirmar la estabilidad de la imagen y la motilidad γδ IEL. Continúe adquiriendo imágenes durante 30 a 60 minutos para cada campo de vellosidades. Registre 2 o 3 campos para cada ratón. Durante la toma de imágenes, controle el ratón cada 5 minutos.
