$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Producción y caracterización de LMPs
NOTA: Para evitar la contaminación, asegúrese de que todos los materiales utilizados en este experimento sean estériles o esterilizados en autoclave. Realice todos los pasos de RT en una cabina de seguridad biológica en condiciones estériles, a menos que se indique lo contrario.
- Estimulación y recogida de MP
- Descongele una alícuota de 10 millones de células T CEM en un baño de agua a 37 °C. Diluir en 10 ml de medio hematopoyético precalentado sin suero como X-VIVO, en un tubo estéril de 15 ml y centrífugar a 200 g x 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en un medio precalentado de 5 ml.
- Transfiera las células a un matraz de cultivo de tejidos T75 (para células en suspensión) con 15 ml de medio hematopoyético precalentado como X-VIVO e incube durante 4 días en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
- Después de 4 días, transfiera todo el medio de cultivo y las células a un matraz de cultivo de tejidos T175 que contenga 100 ml de medio fresco. Continúe incubando las células durante aproximadamente 72 horas en las mismas condiciones hasta que hayan crecido a una densidad de 2 millones de células/ml.
- Divida uniformemente las células entre cuatro matraces T175, cada uno con 150 ml de medio fresco, y continúe el cultivo celular hasta que las células hayan crecido (aproximadamente 48 horas de incubación) hasta una densidad de 2 millones/ml.
- Recoja las células de cada matraz por centrifugación a 200 x g durante 5 min y vuelva a suspender 300 x 106 células en un nuevo matraz T175 que contenga 150 ml de medio fresco, para mantener la densidad de células de 2 millones/ml.
- Añadir actinomicina D (disuelta en DMSO a 2 mg/ml) al medio a una concentración final de 0,5 μg/ml e incubar durante 24 horas.
- Transfiera todo el medio de cultivo a tubos cónicos de 50 ml y centrifuga las células a 750 x g durante 5 min. Transfiera el sobrenadante a tubos cónicos de 50 ml y centrifugue a 1.500 x g durante 15 min para eliminar los fragmentos de células grandes.
- Transfiera el sobrenadante a un frasco de 250 ml y ultracentrifuga a 12.000 x g durante 50 min. Deseche el sobrenadante y recoja los gránulos.
- Lave los gránulos enriquecidos con LMP con 40 ml de PBS estéril en un tubo de 50 ml por centrifugación a 12.000 x g durante 50 min. Repita este paso dos veces.
- Recoger el último sobrenadante de lavado, que se utilizará como control del vehículo. Suspenda los gránulos de LMP en 1 ml de PBS y transfiéralos a un microtubo estéril de 1,5 ml. Alicuone y almacene los LMP aislados a -80 °C (para evitar múltiples ciclos de descongelación libre).