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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Enriquezca las células T CD8+ específicas de antígeno con células presentadoras de antígenos artificiales de nanopartículas preparadas.
- Aísle las células T CD8+.
- Eutanasia de los animales mediante exposición a isoflurano seguida de luxación cervical.
- Extraiga el bazo y los ganglios linfáticos de ratones C57BL/6j de tipo salvaje y colóquelos en una solución de PBS. Macerar los órganos y eluir las células a través de un filtro de células estéril de 70 μm con lavados frecuentes de PBS.
- Para eliminar las células T no CD8+, utilice un kit de aislamiento de células T CD8+ sin contacto y siga las instrucciones del fabricante><.
NOTA: Cada condición de antígeno requiere al menos 3 x 106 linfocitos T CD8+.
- Agregue las nanopartículas aAPC para unirse a las células T CD8+.
- Después del aislamiento, concentrar hasta un volumen de 100 μL en PBS con 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de EDTA.
- Determine el número de aAPC que se agregarán calculando en función de la proporción de 1011 MHC-Ig cargados de péptidos unidos a aAPC por cada 106 células T CD8+.
- Incubar las partículas de aAPC y los linfocitos T CD8+ durante 1 h a 4 °C con mezcla continua en un tubo de poliestireno redondo estéril de 5 mL.
- Prepare medios suplementados y factor de crecimiento de células T (TCGF) para eluir y cultivar células T CD8+.
- Para los medios suplementados, suplementar los medios RPMI 1640 completos (con glutamina) con 1x aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio, 0,4x solución vitamínica, 92 μM de 2-mercaptoetanol, 10 μM de ciprofloxacino y 10% de suero fetal bovino (FBS).
- Para hacer TCGF, siga los protocolos establecidos.
nota: TCGF es un cóctel interno de citoquinas inmunitarias humanas que es esencial para proporcionar a las células T las señales de estimulación adicionales necesarias para crecer. El TCGF podría intercambiarse por citocinas estimuladoras de células T conocidas, como IL-2, IL-7 o IL-15; sin embargo, cada uno puede polarizar la respuesta de las células T en consecuencia.
- Lave y enriquezca la mezcla de células T aAPC y CD8+.
- Lave las partículas magnéticas aAPC, primero usando el tampón PBS con 0.5% de BSA y 2 mM de EDTA, segundo usando medios suplementados y tercero usando medios suplementados con 1% de TCGF.
- Eluir las aAPC y las células T CD8+ enriquecidas en 500 μL de medios suplementados con TCGF al 1%.
- Cuente las células usando un hemocitómetro y una placa en una placa de fondo en U de 96 en 160 μL por pocillo de medio suplementado con TCGF al 1% a una concentración de 2.5 x 105 5 células T CD8+/mL.
- Si se aísla utilizando aAPC con solo MHC-Ig cargado de péptidos en la superficie (sin señales coestimuladoras), complete el paso 4.5. Si se aísla utilizando aAPC con MHC-Ig cargado de péptidos en la superficie y señales coestimuladoras, continúe con el Paso 5.
- Agregue las partículas magnéticas recubiertas con señales coestimuladoras en la superficie a la fracción enriquecida y agregue un campo magnético para agrupar las señales estimuladoras en la superficie de las células T.
- A las fracciones enriquecidas, agregue un anticuerpo estimulador equimolar (o mayor dependiendo de la aplicación; consulte la sección sobre las propiedades de aAPC para controlar) al número de MHC-Ig cargados de péptidos en la partícula.
- Permitir que las partículas magnéticas coestimuladoras se unan a las células T CD8+ enriquecidas durante 1 h a 4 °C.
- Agregue un campo magnético colocando la placa de cultivo entre dos discos magnéticos de neodimio N52 de 1,9 cm (0,75 pulgadas) de longitud.
nota: Los imanes de disco N52 tienen un campo extremadamente fuerte. Se debe tener cuidado de almacenarlos con espaciadores entre imanes, ya que es difícil separarlos entre sí al colocarlos en las placas de cultivo. Para minimizar que los imanes se adhieran a los componentes metálicos de la incubadora, colóquelos en recipientes de espuma de poliestireno de tubo cónico de 50 ml tanto en la parte inferior como en la superior.
>2. Expanda y detecte células T CD8+ específicas de antígeno con células presentadoras de antígeno artificiales de nanopartículas preparadas
- Agregue la placa de pocillos de fondo en U de 96 con aAPC y células T CD8+ en una incubadora humidificada con 5% de CO2, 37 °C durante 3 días. El día 3, alimente las células con 80 μL por pocillo de medio suplementado con TCGF al 2% y colóquelas de nuevo en la incubadora hasta el día 7.
- El día 7, coseche las células estimuladas en un tubo de fondo redondo de 5 ml para contar.
- Una vez que se haya recolectado toda la solución, centrifuga las células recolectadas para resuspender en 0,5 mL de PBS con 0,05% de azida de sodio y 2% de FBS. Cuente las células viables tiñéndolas con azul de tripán y contando con un hemocitómetro.
- Retire entre 50.000 y 500.000 células contadas en dos nuevos tubos de fondo redondo de 5 ml para la tinción específica del antígeno. Se usará un tubo para la tinción de péptido afín-MHC y el otro tubo para la tinción no cognada para determinar la tinción de fondo.
- Añadir 1 μg de MHC-Ig biotinilado a los respectivos tubos afines y no cognados en 100 μL de PBS con azida sódica al 0,05% y FBS al 2% con aloficocianina (APC) anti-ratón CD8a de rata, clon 53-6,7 (relación de dilución de 1:100) durante 1 h a 4 °C.
- Agregue estreptavidina secundaria y mancha de muertos vivos. Lave el exceso de MHC-Ig biotinilado con PBS mediante centrifugación. A continuación, tiñir todas las muestras con una proporción de 1:350 de estreptavidina marcada con ficoeritrina (PE) y una proporción de 1:1000 de una tinción de células muertas verdes vivas/muertas fijables durante 15 min a 4 °C.
- Lea todas las muestras en un citómetro de flujo para determinar la especificidad y el número de células específicas de antígeno.
- Lave el exceso de manchas secundarias y vivas/muertas mediante centrifugación y vuelva a suspender con 150 μL de tampón PBS con azida de sodio al 0,05 % y FBS al 2 % para leer en un citómetro de flujo.
- Determine el número y el porcentaje de células específicas de antígeno con software de análisis de datos.
- Para determinar el porcentaje de células específicas de antígeno, utilice las siguientes puertas en el orden respectivo live+, lymphocityte+ (dispersión directa por dispersión lateral), CD8+ y Dimer+. Determine la puerta Dimer+ comparando la tinción no cognada con la afín.
- Determine el porcentaje de células específicas de antígeno en una muestra restando el porcentaje de dímero+ de la tinción MHC-Ig afín de la tinción MHC-Ig no cognada.
- Usando este porcentaje de células específicas de antígeno, multiplíquelo por el número de células contadas, obteniendo el número de células específicas de antígeno resultante del enriquecimiento y la expansión.
nota: La compensación tendrá que establecerse en el citómetro de flujo, ya que hay superposición espectral con los fluoróforos utilizados en este panel.