Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Aislamiento de PMC por lavado intraperitoneal
- Antes del aislamiento de la celda, prepare los materiales enumerados en la Tabla 1.
- Utilice ratones machos de 8 a 14 semanas de edad para el aislamiento de PMC. Eutanasia a un ratón por inhalación de CO2 y confirmar la muerte por pérdida de reflejos. Rocíe el ratón con etanol al 70% y fíjelo en un bloque de espuma con alfileres (con el lado dorsal hacia abajo). Retire la piel ventral del ratón con unas tijeras de borde romo. Evite dañar la cavidad peritoneal.
nota: Por lo general, utilizamos este protocolo para ratones con un fondo genético de cepa C57BL/6N.
- Inyecte 7 mL del medio RPMI helado y 5 ml de aire en la cavidad peritoneal utilizando una jeringa de 10 mL equipada con una aguja de 27 G. Empuje la aguja con cuidado en el peritoneo y no perfore ningún órgano. Use un punto en la región de la grasa del epidídimo para reducir el riesgo de perforación del órgano.
- Después de la inyección, agite el ratón durante 1 minuto para separar las células peritoneales en el medio RPMI. No agite el ratón con demasiada fuerza, para evitar dañar los órganos internos y contaminar la cavidad peritoneal con la sangre.
- Reutilice la jeringa de 10 ml equipándola con una nueva cánula de 20 G. Mueva los órganos internos hacia un lado inclinando el bloque de espuma y golpeándolo suavemente en el banco para facilitar la aspiración media desde el otro lado. Inserte una aguja de 20 G, biselela y aspire el líquido del abdomen suave y lentamente (~0,5 mL/s) para evitar la obstrucción de los órganos internos. Recoja la mayor cantidad de líquido posible (por lo general, de 5 a 6 ml).
- Retire la aguja de la jeringa y transfiera la suspensión celular recolectada a un tubo de recolección en hielo. Deseche un tubo de muestra si hay contaminación sanguínea visible.
- Centrifugar los tubos con la suspensión celular a ~300 x g durante 5 min. Bajo una campana estéril aspirar el sobrenadante. Para cada ratón, combine los gránulos de muestra en 4 ml de medio PMC frío (4-10 °C) y transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo de25 cm2. Agregue los factores de crecimiento IL-3 y SCF a las concentraciones finales de 10 ng/mL y 30 ng/mL, respectivamente. Coloque el matraz que contiene las células en una incubadora (37 °C y 5% de CO2) e incube durante ~48 h hasta el siguiente procedimiento.
Tabla 1: Materiales para el Paso 1.
| 1 | hielo |
| número arábigo | Jeringas de 10 mL |
| 3 | Agujas de 27 g |
| 4 | Agujas de 20 g |
| 5 | Bloque y pasadores de espuma de poliestireno |
| 6 | Tubos de recolección (tubos de centrífuga de plástico de 50 mL) |
| 7 | 70% etanol |
| 8 | RPMI Medio (Pre enfriado y mantenido en hielo) |
| 9 | PMC Medium: RPMI Medio + 20% FCS (Suero Fetal de Ternero) + 1% Penicilina Solución de estreptomicina (Pen-Strep) |
| 10 | Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco - DPBS (sin Ca2+ y Mg2+) |
| 11 | Frascos de cultivo (25 cm) |
| 12 | Factores de crecimiento soluciones madre (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL) |
| 13 | Pipetas serológicas (10 mL) |
| 14 | Puntas de pipeta estériles (20–200 μL) |
| 15 | Hemotómetro |
| 16 | Centrífuga de sobremesa |
| 17 | Tijeras y pinzas |
| 18 | Cámara de CO2 para ratones |
| 19 | Campana estéril abierta |
| 20 | Campana estéril cerrada |
| 21 | Incubadora de células (37 °C y 5% de CO2) |
| 22 | Pipetas de transferencia (20–200 μL) |