Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Fabricación de dispositivos y litografía blanda
NOTA: Se utilizaron técnicas estándar de litografía blanda para crear el microcanal de polidimetilsiloxano (PDMS).
- Mezcle el precursor de PDMS en una proporción de 10:1 de base y agente de curado.
- Vierta 30 g de la mezcla precursora de PDMS en el molde de aluminio micromecanizado (consulte la Figura 1 para conocer las dimensiones) y 20 g de la mezcla precursora de PDMS en la placa de Petri de 100 mm.
nota: La placa de Petri se utiliza para hacer la película gruesa de PDMS (~3 mm) para la capa de soporte. La capa de soporte de PDMS proporciona propiedades físicas uniformes de la superficie en toda la microfluídica. Alternativamente, se puede utilizar una película delgada de PDMS en el portaobjetos de vidrio. El molde maestro con dimensiones de canal específicas se diseñó y fabricó mediante microfresado en la lámina de aluminio. El canal en espiral utilizado en este estudio fue un microcanal en espiral de 8 bucles con una entrada y dos salidas, con un radio que aumentó de 8 mm a 24 mm para una separación eficiente basada en el tamaño.
- Coloque el molde y la placa de Petri en un desecador al vacío para desgasificar hasta que no haya burbujas visibles en la superficie, generalmente de 5 a 10 minutos. Use una aspiradora doméstica para el desecador.
- Libere el vacío y coloque el molde y la placa de Petri en un horno a 90 °C durante 1 h.
nota: Se puede utilizar una placa calefactora u otras herramientas de calentamiento en lugar de un horno.
- Retira el molde y la placa de Petri del horno y deja que se enfríe a temperatura ambiente durante 10 min.
- Recorte con cuidado el contorno y perfore los orificios de acceso al fluido en el dispositivo con un perforador de 2 mm.
nota: El tamaño del punzón puede variar según el tamaño del tubo o la guía de fluido.
- Adherir una cinta adhesiva al lado del canal del dispositivo y una película gruesa de PDMS, y pelar cuidadosamente con pinzas para eliminar el polvo.
- Trate tanto el lado del canal del dispositivo como el PDMS simple con plasma de aire y únalo con la capa de soporte preparada de PDMS simple (Figura 1A).
- Coloque la viruta en el portaobjetos de vidrio de 50 mm x 70 mm y colóquela en un horno a 70 °C durante al menos 30 minutos para mejorar la fuerza de unión.
>2. Recolección de secreciones traqueales de pacientes con ventilación mecánica
NOTA: Las secreciones traqueales se pueden obtener de pacientes con ventilación mecánica durante el cuidado normal de las vías respiratorias de rutina mediante el uso de un protocolo modificado de los métodos convencionales para adaptarse al paciente adulto estándar con ventilación. Las muestras fueron anonimizadas y enviadas inmediatamente para su procesamiento.
- Si está indicada la aspiración traqueal, se utiliza un catéter para extraer las secreciones de las vías respiratorias.
- Avance el catéter con cuidado hasta la mitad del tubo endotraqueal e instilar 5 mL de solución salina normal estéril al 0,9% de una jeringa precargada de 10 mL.
- Cuando el catéter esté completamente avanzado o se encuentre resistencia, aspire las secreciones y recójalas en un recipiente estéril de recolección de esputo.
- Recoja 10 ml de secreciones traqueales en un recipiente de esputo estéril y colóquelo sobre hielo. Envíe las muestras inmediatamente para su procesamiento.
>3. Preparación de la muestra de secreción traqueal
NOTA: Todos los experimentos deben realizarse bajo una cabina de bioseguridad con el equipo de protección personal adecuado.
- Disperse 1 mL de muestras de secreción de las vías respiratorias en 9 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) utilizando una jeringa de plástico de 10 mL (para una dilución 10x). Utilice una pipeta roma para homogeneizar la muestra de moco.
- Cuele el diluyente con un colador de células de nailon de 40 μm para eliminar trozos grandes o coágulos de sangre, que pueden bloquear el orificio de acceso microfluídico o el canal. Coloque la muestra en el hielo después del procesamiento.
- Disperse el diluyente de cada muestra utilizando un volumen de 100x de tampón PBS, lo que da como resultado una suspensión diluida de 1.000x. Coloque la muestra en el hielo durante toda la operación de disociación.
>4. Configuración experimental
NOTA: Todos los experimentos deben realizarse bajo una cabina de bioseguridad con el equipo de protección personal adecuado.
- Ensamble el chip PDMS con la guía de fluido para aplicar un flujo uniforme a cada uno de los cuatro microcanales en espiral (Figura 1B).
nota: Se utilizaron cuatro canales para aumentar el rendimiento mediante paralelización, así como para optimizar el volumen y la densidad de celdas de la suspensión resultante. La guía de fluidos está diseñada y fabricada con una impresora 3D tipo estereolitografía con resina transparente. El puerto de entrada y salida de la guía de fluido utiliza conectores Luer hembra para facilitar la conexión y un sellado estable durante la operación.
- Conecte un conector Luer macho de 1/16 de pulgada a la entrada, la salida de pared interna (IW) y el puerto de salida de pared exterior (OW) de la guía de fluido y conecte un tubo de silicona a la suspensión de muestra.
- Inserte las puntas romas en cada extremo de la entrada y las salidas para llegar al fondo del depósito de muestra.
- Conecte la bomba peristáltica con el tubo de entrada.
- Coloque el extremo del tubo de entrada y el tubo de salida IW en el depósito de muestra y coloque el extremo del tubo de salida OW en el depósito de residuos (Figura 1C, D).
- Coloque el tubo de 50 mL de PBS filtrado sin calcio ni magnesio en el depósito de muestra.
- Comience a bombear a un caudal bajo (~1 mL/min) para cebar el dispositivo.
nota: Cuando se capturen burbujas en el canal, empuje la parte superior del canal con la pinza para desestabilizar y eliminar las burbujas de aire. Cuando el dispositivo esté completamente lleno con la solución tampón, cambie el tubo de PBS para preparar el tubo de muestra de secreción de las vías respiratorias.
- Cuando la muestra se coloque en el depósito de muestras, encienda la bomba peristáltica y ajuste el caudal a 4 mL/min (Figura 1C, D).
- Cuando el volumen de la muestra alcance el volumen designado (~1 mL), detenga la operación y desconecte el tubo de silicona.
nota: El método propuesto es más eficiente para reducir un gran volumen de diluyente (>50 mL) en un volumen de tubo de microcentrífuga (~1 mL) (Figura 2).
