Marcaje de linfocitos T auxiliares murinos mediante anticuerpos monoclonales radiomarcados

Resumen

Fuente: Hoffmann, S. H. L., et al., Marcaje de linfocitos murinos por ⁶⁴receptores de anticuerpos Cu dirigidos para el tráfico de células in vivo por PET/CT. J. Vis. Exp. (2017)

En este video, demostramos el radiomarcaje intracelular de células T auxiliares utilizando anticuerpos monoclonales conjugados con isótopos radiactivos para imágenes de tomografía por emisión de positrones no invasivas.

Protocolo

1. Radiomarcaje de células cOVA-TH1

NOTA: El ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb se aplicará a las células cOVA-TH1 cultivadas para permitir el marcaje radiactivo intracelular.

1. Para el radiomarcaje de células cOVA-TH1, extraiga 37 MBq del ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcado en una jeringa sin volumen muerto utilizando un calibrador de dosis. Agregue 1 mL de solución salina para recibir una solución de 37 MBq/mL.
2. Suspenda las células cOVA-TH1 en el medio a 2 x 10⁶ células/mL y añada 0,5 mL de la suspensión celular a cada pocillo en una placa de 48 pocillos.
3. Agregue 20 μL de la solución de 37 MBq/mL ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb recién preparada a cada pocillo de la placa de 48 pocillos. La proporción final para el marcaje es de 0,7 MBq por 10⁶ células en un volumen de 520 μL. Incubar a 37 °C y 7,5% de CO₂ durante 30 min.
4. Después de la incubación, vuelva a suspender cuidadosamente las células en cada pocillo y transfiera la suspensión celular de la placa de 48 pocillos a un tubo con tapón de rosca de 50 mL. Para minimizar la pérdida de células, enjuague cada pocillo con un medio precalentado.
5. Centrifugar la suspensión celular cOVA-TH1 a 400 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y resuspender las celdas en PBS precalentado de 10 mL. Retire una alícuota de la suspensión celular para el recuento de células. Repita el paso de lavado.
6. Cuente las células cOVA-TH1 viables en una dilución adecuada con tinción con azul de tripano.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Módulo de trabajo de 64Cu	WKL	Hecho a medida	Producción de 64Cu
Calibrador de dosis	Capintec	CRC-25R
Ciclotrón PETtrace	Sistemas Médicos de General Electric
DOTA-NHS	Macrocíclicos	B-280
Anticuerpo anti-cOVA-TCR (KJ1-26)		Aislado de cultivo de células de hibridoma	DOTA-conjugación
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	71633	DOTA-conjugación
H+ Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901	DOTA-conjugación
Unidad de filtrado Amicon Ultra-15	Merck Millipore	UFC910008	DOTA-conjugación
Agua ultrapura de Rotipuran	Carl Roth	HN68.3	DOTA-conjugación
Acetato de amonio	Sigma-Aldrich	32301	DOTA-conjugación
Pbs	Universidad de Tubinga		DOTA-conjugación
Columna Micro Bio-spin P-6	Laboratorios Bio-Rad	7326221	DOTA-conjugación
Citrato de sodio	Sigma-Aldrich	71497	DOTA-conjugación
Cyclone Plus PhosphorImager	Perkin-Elmer	L2250116	DOTA-conjugación
DMEM	Merck Millipore	102568	Ingrediente para el medio de células T
Fcs	Merck Millipore	S0115/1004B	Ingrediente para el medio de células T
Piruvato de sodio	Merck Millipore	L0473	Ingrediente para el medio de células T
MEM-aminoácidos	Merck Millipore	K0293	Ingrediente para el medio de células T
HEPES	Merck Millipore	L 1613	Ingrediente para el medio de células T
Penicilina/Estreptomicina	Merck Millipore	A2212	Ingrediente para el medio de células T
0,05 mM 2-β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	Ingrediente para el medio de células T
Ratones DO11.10		Cría propia	Cultivo celular TH1
DPBS	Gibco	14190144	Cultivo celular TH1
Filtro de células 40 μm	Corning	352340	Cultivo celular TH1
Búfer de lisado ACK	Lonza	10-548E	Cultivo celular TH1
CD4 MicroBeads, ratón	Miltenyi Biotech	130-097-145	Cultivo celular TH1
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotech	130-090-976	Cultivo celular TH1
Columna LS	Miltenyi Biotech	130-042-401	Cultivo celular TH1
Anticuerpo anti-CD4 (Gk1.5)		Aislado de cultivo de células de hibridoma	Cultivo celular TH1
Anticuerpo anti-CD8 (5367.2)		Aislado de cultivo de células de hibridoma	Cultivo celular TH1
Anticuerpo anti-ratas (MAR18.5)		Aislado de cultivo de células de hibridoma	Cultivo celular TH1
Complemento de conejo MA	tebu-Bio	CL3221	Cultivo celular TH1
Anticuerpo anti-IL-4 (11B11)		Aislado de cultivo de células de hibridoma	Cultivo celular TH1
Péptido cOVA 323-339	Micro-colecciones EMC	Pedido personalizado	Cultivo celular TH1
CPG1668-oligonucleótidos	Eurofins MWG Operón	Pedido personalizado	Cultivo celular TH1
IL-2	Novartis	65483-116-07	Cultivo celular TH1
Placas de 96 pocillos	Greiner	655180	Cultivo celular TH1
Placas de 24 pocillos	Greiner	662160	Cultivo celular TH1
Matraz de cultivo celular	Greiner	660175	Cultivo celular TH1
Placas de 48 pocillos	Greiner	677 180	Etiquetado de células
Gammacell 1000	Los mejores Theratronics	Vía consulta
Gulmay RT225	Gulmay	Vía consulta
Azul de tripano	Merck Millipore	L6323	Evaluación in vitro