Una técnica in vitro para diferenciar las células T auxiliares productoras de GM-CSF de las células T vírgenes

Resumen

Fuente: Lu, Y., et al. Diferenciación in vitro de células T Helper (T_HGM) productoras de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM) de ratón.J. Vis. Exp. (2018).

Este video demuestra la diferenciación in vitro del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos o de las células T auxiliares productoras de GM-CSF (T_HGM). Las células T vírgenes aisladas se estimulan para su diferenciación en T_HGM, lo que se confirma mediante la detección de una alta producción intracelular de GM-CSF y una baja expresión de otras citocinas específicas de las células T auxiliares.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de reactivos y materiales

1. Prepare 500 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 2% de suero fetal bovino (FBS) y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
   nota: Mantenga el tampón en hielo durante todo el procedimiento para obtener resultados óptimos.
2. Prepare 50 mL de medios RPMI completos que contengan RPMI 1640, 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Utilice medios RPMI completos que contengan 50 μM de β-mercaptoetanol para la diferenciación de células T_HGM. Agregue el β-mercaptoetanol a una campana extractora.
3. Prepare 7,5 mL de una mezcla de anticuerpos anti-CD3e diluyendo el stock concentrado anti-CD3e a 3 μg/mL en PBS. Cubra las placas de 48 pocillos añadiendo 150 μL de la mezcla de anticuerpos a cada pocillo e incube la placa a 37 °C durante al menos 1 h, o a 4 °C durante la noche.
4. Esterilice un par de tijeras y fórceps y manténgalos en etanol al 70% entre disecciones.

>2. Preparación de esplenocitos murinos

1. Sacrificar al ratón (de 6 a 8 semanas de edad) utilizando un sistema aprobado institucionalmente para la asfixia por CO₂ o la dislocación cervical. Rocíe el ratón con etanol al 70% y móntelo en un bloque de poliestireno en su parte posterior. Transfiera el mouse a un gabinete de seguridad biológica para continuar con los siguientes pasos.
2. Sujete la piel con un par de pinzas y corte la piel por debajo de la caja torácica en el lado izquierdo durante unos 4 cm, con unas tijeras. Abra el saco peritoneal para exponer el bazo y use pinzas estériles para extraer el bazo.
3. Coloque un colador de células de 70 μm en un tubo de 50 ml y humedézcalo previamente con 2 ml de tampón. Coloque los bazos en el colador de células (2-3 bazos por un colador de células) y macere con el extremo de un émbolo de jeringa de 5 ml.
4. Enjuague el colador y el tubo varias veces con 1-2 ml de tampón de aislamiento celular hasta que todas las células se hayan enjuagado en el tubo. Deseche el filtro de células y centrifugue las células a 350 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
5. Vuelva a suspender el pellet de celda con 5 mL de tampón de lisado de amonio-cloruro de potasio (ACK) frío (4 °C) (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA; pH 7,2-7,4) y mézclelos suavemente durante 2 min. Agregue 10 mL de medio RPMI completo para neutralizar el tampón ACK e inmediatamente centrifugue las celdas a 350 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación.

>3. Aislamiento de linfocitos T CD4⁺ utilizando microperlas magnéticas CD4 y una columna de separación celular

1. Vuelva a suspender el pellet de celda en 5 mL de tampón de aislamiento celular. Filtre la suspensión celular con un filtro de preseparación (30 μm) en un nuevo tubo de 15 ml para eliminar cualquier residuo.
2. Tome 10 μL de la suspensión celular y haga una dilución 10x añadiendo 90 μL del tampón. Tome 10 μL de la suspensión celular diluida y mézclela con 10 μL de azul de tripano para el recuento de células. Cuente las células en un hemocitómetro para determinar el rendimiento de células viables.
3. Centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
4. Vuelva a suspender las células en 90 μL de tampón por cada 10⁷ células. Añadir 10 μL de microperlas magnéticas CD4 por cada 10⁷ células. Incubar las células durante 15 min a 4 °C. Para obtener resultados óptimos, mezcle suavemente la suspensión celular cada 5 minutos durante la incubación.
5. Mientras las células se incuban, coloque una columna de separación en el soporte magnético. Humedecer previamente la columna con 2 mL de tampón.
6. Al final de la incubación de la célula/perla, lavar las células con 5 mL de tampón y centrifugarlas a 350 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
7. Vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón, cargue la muestra en la columna de separación de células y deje que fluya. Utilice un tubo de centrífuga de 15 ml para recoger la fracción de células CD4. Añadir 1 mL de tampón para lavar el depósito antes de que se seque. Repita el paso de lavado 2 veces.
8. Retire la columna de separación de células del soporte magnético y colóquela en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mL. Agregue 2 mL de tampón de aislamiento celular a la columna de separación de celdas y aplique el émbolo firmemente para forzar las celdas fuera de la columna.
9. Centrifugar la fracción a 350 x g durante 5 min a 4 °C para obtener células CD4⁺. Deseche el sobrenadante.

>4. Purificación de las células T CD4⁺ naive (CD4⁺CD25-CD44^loCD62L^hi) mediante clasificación de células activadas por fluorescencia y diferenciación de T_HGM

1. Vuelva a suspender el pellet de célula CD4⁺ obtenido en 500 μL de tampón. Mezcle las células con una mezcla de anticuerpos fluorescentes conjugados que contenga CD4-PerCp (2,8 μg/mL), CD44-APC (2,4 μg/mL), CD25-PE (2 μg/mL) y CD62L-FITC (10 μg/mL) (Tabla 1). Incubar las células en hielo durante 20-30 min, protegiéndolas de la luz.
   nota: Las concentraciones de los anticuerpos se optimizaron previamente en el laboratorio. El número de anticuerpos enumerados es para células de 1 a 2 ratones.
2. Después de la incubación, lavar las células con 5 mL de tampón y centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 °C.
3. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón. Vuelva a filtrar las celdas con una malla de nylon.
4. Transfiera la suspensión de células a un tubo FACS para la clasificación de células. Precubra los tubos FACS de recolección con 500 μL de tampón.
5. Obtener una población de CD4⁺CD25-CD44^loCD62L hi (de linfocitos T CD4⁺ naïve) mediante clasificación FACS. Primero conecte CD4 ⁺ CD25^- y luego seleccione las células CD44^loCD62L^hi de esta población.
6. Recoja las fracciones de células T CD4⁺ vírgenes en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
7. Vuelva a suspender los linfocitos T CD4⁺ vírgenes a una concentración de 106 células/ml en medios RPMI completos que contengan 50 μM de β-mercaptoetanol.
8. Aspire los anticuerpos anti-CD3e utilizados para el recubrimiento previo en la placa de 48 pocillos. Siembre 0,25 millones (250 μL) de células en cada pocillo con IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 μg/mL) y anti-IFNγ (10 μg/mL) (Tabla 1).
   nota: Las concentraciones de citocinas y anticuerpos se optimizaron previamente en el laboratorio para una diferenciación de célulasGMT.
9. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO₂ durante 3 días. No cambie el medio durante la incubación.

>5. Análisis de las células T_HGM de ratón generadas in vitro

1. Con un microscopio, compruebe la diferenciación celular 3 días después de la diferenciación. Recolectar las células y centrifugarlas a 350 x g durante 5 min a 4 °C. Lavar las células 2 veces con medios RPMI completos.
   nota: Las células diferenciadas son más grandes que las células T CD4⁺ vírgenes.
2. Vuelva a suspender las células en 1 mL de medio RPMI completo. Tome 10 μL de suspensión celular y mézclelo bien con 10 μL de azul de tripán para determinar el número de células con un hemocitómetro. Divida las células diferenciadas en tres pociones para su reestimulación y análisis.
   nota: La tinción de citocinas intracelulares requiere ≥0,5 millones de células.
3. Para la tinción de citocinas intracelulares, reestimule las células con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) e ionomicina (1 μg/mL) en presencia de un inhibidor del transporte de proteínas (1 μL/mL) durante 4-6 h.
   1. Extraiga las células y tíñalas con anticuerpo anti-CD4 (conjugado con PerCP, 0,2 mg/mL, dilución 1:100; o conjugado con FITC, 0,5 mg/mL, dilución 1:100) durante 30 min.
   2. Fije las células con 200 μL de tampón de fijación durante 20-60 min. Después de la fijación, lavar las células 2 veces con 1 mL de tampón de permeabilidad.
   3. Realizar tinción intracelular con anticuerpos contra GM-CSF (conjugado con PE, 0,2 mg/mL, dilución 1:100), IL-17A (conjugado con FITC, 0,5 mg/mL, dilución 1:100; Conjugado con APC, 0,2 mg/mL, dilución 1:100), IL-4 (conjugado con APC, 0,2 mg/mL, dilución 1:100) e IFNγ (conjugado con APC, 0,2 mg/mL, dilución 1:100; Conjugado con PE, 0,2 mg/mL, dilución 1:100) durante 30 min en la oscuridad.

Tabla 1: Citocinas y anticuerpos utilizados.

nombre	Concentración de existencias	Concentración de trabajo	dilución	Volumen en tampón de tinción de 500 μL
CD4-PerCp	0,2 mg/mL	2,8 μg/ml	1:71	7 μL
CD44-APC	0,2 mg/mL	2,4 μg/mL	1:83	6 μL
CD25-PE	0,2 mg/mL	2 μg/mL	1:100	5 μL
CD62L-FITC	0,5 mg/mL	10 μg/mL	1:50	10 μL
GM-CSF-PE	0,2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IL-17A-FITC	0,5 mg/mL	5 μg/mL	1:100
IL-17A-APC	0,2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IFNγ-APC	0,2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IFNγ-PE	0,2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IL-4-APC	0,2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
CD4-FITC	0,5 mg/mL	5 μg/mL	1:100
IL-7	20 μg/mL	2 ng/mL	1:10000
Anti-CD28	0,5 mg/mL	1 μg/mL	1:500
Anti-IFNγ	1 mg/mL	10 μg/mL	1:100

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI 1640	Biooeste	L0500-500
FBS inactivado por calor	Capricornio	FBS-HI-12A
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122
10x PBS	1ª Base	BUF-2040-10	Diluido a 1x PBS en agua estéril
EDTA	1ª Base	BUF-1053-100ml-pH8.0
Búfer ACK 10X	Bioleyenda	420301	diluido en agua estéril
Filtro de células	SPL Ciencias de la Vida	93070
Microperlas CD4	Miltenyi Biotec	130-049-201
2-Mercaptoetanol	sigma	M7522
Columna LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Soporte magnético	Miltenyi Biotec	130-042-303
Jeringa de 1 ml	Terumo	SS+01T
centrífuga	Eppendorf	Eppendorf 5810R
Clasificador de celdas Sony SY3200	Sony	Clasificador de celdas Sony SY3200
Tubo de centrífuga cónico de 50 ml	Greiner Bio-One	210261
Tubo de centrífuga cónico de 15 m	Greiner Bio-One	188271
Tubo FACS	Corning	352054
anti-ratón CD4 PerCP-eFluor 710	eBiociencia	46-0041-82
CD25 antiratón conjugado con PE (IL-2Ra, p55)	eBiociencia	12-0251-82
antihumano/ratón CD44 APC	eBiociencia	17-0441-82
anti-ratón CD62L FITC	eBiociencia	11-0621-85
Cámara de recuento mejorada por Neubauer	Marienfeld	640010
Hyclone Solución Azul de Tripán	GE Healthcare Ciencias de la Vida	SV30084.01
microscopio	Nikon	Nikon Elipse TS100
Anticuerpo CD3e anti-ratón purificado	Bioleyenda	100314
Hámster purificado anti-ratón CD28	BD Biociencias	553295
Rata purificada anti-ratón IFNγ	eBiociencia	Teléfono 16-7312-85
Anticuerpo IL-4 anti-ratón purificado	Bioleyenda	504102
Proteína IL-7 recombinante de ratón	Sistema de investigación y desarrollo	407-ML
PMA	Merck Millipore	De 19 a 144
Ionomicina	sigma	I0634
GolgiPlug Inhibidor del transporte de proteínas	BD Biociencias	51-2301KZ
Juego de tampones de fijación intracelular y permeabilización	eBiociencia	88-8824-00
anti-ratón GM-CSF PE	eBiociencia	Teléfono 12-7331-82
FITC anti-ratón IL-17A	Bioleyenda	506908
IFN-gamma antiratón de APC	Bioleyenda	505810