Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Disociación cerebral y aislamiento microglial magnético
NOTA: Todas las manipulaciones y resuspensiones celulares deben realizarse con una pipeta de 1.000 μL con mucha precaución. La aplicación de una acción mecánica alta puede activar o matar las células de la microglía.
- Transfiera 12 piezas de cerebro (~ 1,2 g) por tubo de disociación que contenga la mezcla de disociación de acuerdo con la Tabla 1. Para 24 cachorros, se necesitarán cuatro tubos en C (Figura 1A-B).
- Coloque los tubos C en el disociador (con el modo de calentamiento). Inicie el programa NTDK optimizado en el equipo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1D).
- Centrifugar a 300 x g durante 20 s (a 4 °C) para recoger todas las células. Complete la disociación mecánica pipeteando tres veces hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL (Figura 1E).
- Transfiera las células a cuatro tubos de 15 mL + coladores. Enjuague los filtros con 10 mL de 1x Solución Salina Balanceada de Hanks (HBSS) con Ca2+ y Mg2+ (HBSS+/+) (Figura 1F).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender cuidadosamente el pellet con 10 mL de HBSS+/+ (Figura 1G).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender cuidadosamente el pellet con 6 mL de tampón de clasificación (1x PBS + 0,5% BSA) (Figura 1H).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Añadir 200 μL de solución de microperlas CD11b por tubo y resuspender cuidadosamente (Figura 1I).
- Incubar los tubos durante 15-20 min a 4 °C. Vuelva a suspender cuidadosamente el pellet con 6 mL de tampón de clasificación (Figura 1I-J).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender con cuidado el pellet con 8 mL de tampón de clasificación (Figura 1K).
- Siga el programa POSSEL en el separador (ver Tabla de Materiales) para preparar ocho columnas. Transfiera las células de 1 mL por 1 mL en la columna. Espere a que pasen todas las células antes de agregar otro mL. Eluir las células CD11b+ en una placa de elución estéril con 1 mL de tampón de clasificación (Figura 1L).
- Agrupe las células CD11b+ en un nuevo tubo de 50 mL (Figura 1M).
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender cuidadosamente el pellet con 10 mL de medio de microglía frío (medio de cultivo sin suero de macrófagos (SFM) + 1% de penicilina-estreptomicina (P/S)) (Figura 1N).
- Cuente las células CD11b+. En P8, uno debería obtener ~ 650,000 células por cerebro.
nota: En el presente protocolo, las células se contaron utilizando un contador de células automatizado (ver Tabla de Materiales).
- Vuelva a suspender las células en medio de microglía frío hasta una concentración final de 650.000-700.000 células/mL y dispense en placas de cultivo celular.
nota: Las placas de 6 pocillos son para Western Blot (2 mL por pocillo); las placas de 12 pocillos son para el análisis RT-qPCR (1 mL por pocillo) y las placas de 96 pocillos son para el ensayo fagocítico (250 μL por pocillo).
Tabla 1: Preparación de la mezcla de disociación.
| solución | Para un tubo C (μL) | Para cuatro tubos C (μL) |
| Búfer X | Año 2850 | 11400 |
| Enzima P (papaína) | 75 | 300 |
| Enzima A (ADNasa) | 15 | 60 |
| Búfer Y | 30 | 120 |
| total | Año 2970 | Año 11880 |
