Aislamiento magnético de microglía a partir de cerebros de cachorros de ratón

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Disociación cerebral y aislamiento microglial magnético

NOTA: Todas las manipulaciones y resuspensiones celulares deben realizarse con una pipeta de 1.000 μL con mucha precaución. La aplicación de una acción mecánica alta puede activar o matar las células de la microglía.

1. Transfiera 12 piezas de cerebro (~ 1,2 g) por tubo de disociación que contenga la mezcla de disociación de acuerdo con la Tabla 1. Para 24 cachorros, se necesitarán cuatro tubos en C (Figura 1A-B).
2. Coloque los tubos C en el disociador (con el modo de calentamiento). Inicie el programa NTDK optimizado en el equipo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1D).
3. Centrifugar a 300 x g durante 20 s (a 4 °C) para recoger todas las células. Complete la disociación mecánica pipeteando tres veces hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL (Figura 1E).
4. Transfiera las células a cuatro tubos de 15 mL + coladores. Enjuague los filtros con 10 mL de 1x Solución Salina Balanceada de Hanks (HBSS) con Ca²⁺ y Mg²⁺ (HBSS+/+) (Figura 1F).
5. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender cuidadosamente el pellet con 10 mL de HBSS+/+ (Figura 1G).
6. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender cuidadosamente el pellet con 6 mL de tampón de clasificación (1x PBS + 0,5% BSA) (Figura 1H).
7. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Añadir 200 μL de solución de microperlas CD11b por tubo y resuspender cuidadosamente (Figura 1I).
8. Incubar los tubos durante 15-20 min a 4 °C. Vuelva a suspender cuidadosamente el pellet con 6 mL de tampón de clasificación (Figura 1I-J).
9. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender con cuidado el pellet con 8 mL de tampón de clasificación (Figura 1K).
10. Siga el programa POSSEL en el separador (ver Tabla de Materiales) para preparar ocho columnas. Transfiera las células de 1 mL por 1 mL en la columna. Espere a que pasen todas las células antes de agregar otro mL. Eluir las células CD11b+ en una placa de elución estéril con 1 mL de tampón de clasificación (Figura 1L).
11. Agrupe las células CD11b+ en un nuevo tubo de 50 mL (Figura 1M).
12. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender cuidadosamente el pellet con 10 mL de medio de microglía frío (medio de cultivo sin suero de macrófagos (SFM) + 1% de penicilina-estreptomicina (P/S)) (Figura 1N).
13. Cuente las células CD11b+. En P8, uno debería obtener ~ 650,000 células por cerebro.
    nota: En el presente protocolo, las células se contaron utilizando un contador de células automatizado (ver Tabla de Materiales).
14. Vuelva a suspender las células en medio de microglía frío hasta una concentración final de 650.000-700.000 células/mL y dispense en placas de cultivo celular.
    nota: Las placas de 6 pocillos son para Western Blot (2 mL por pocillo); las placas de 12 pocillos son para el análisis RT-qPCR (1 mL por pocillo) y las placas de 96 pocillos son para el ensayo fagocítico (250 μL por pocillo).

Tabla 1: Preparación de la mezcla de disociación.

Figura 1: Representación esquemática de las disociaciones cerebrales y el aislamiento de las células microgliales. (A-C) Después de la disección del cerebro del ratón P8 y la extracción de los bulbos olfativos y el cerebelo, los cerebros se transfirieron primero a una placa de Petri con HBSS+/+, y luego a tubos de disociación que contenían la mezcla de disociación. Los tubos C se colocaron en el disociador (con el modo de calentamiento) y se inició el programa NTDK (D). (E) Al final del programa, los tubos se centrifugaron a 300 x g durante 20 s a 4 °C; A continuación, la disociación se completó pipeteando tres veces hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL. (F) A continuación, las células se transfirieron a tubos de 15 mL + filtros de 70 μm y se enjuagaron con 10 mL de HBSS+/+. (G) A continuación, las muestras se centrifugaron a 300 x g durante 10 min a 4 °C, se retiró el sobrenadante y el pellet se resuspendió con 10 mL de HBSS+/+. (H) Los tubos se centrifugaron nuevamente a 300 x g durante 10 min a 4 °C; se retiró el sobrenadante y luego se resuspendió el pellet en 6 mL de tampón de clasificación. (I) Los tubos se centrifugaron a 300 x g durante 10 min a 4 °C, se eliminó el sobrenadante y se añadió la solución de microperlas CD11b (200 μL). Los tubos se incubaron durante 15-20 min a 4 °C, y luego se resuspendieron en 6 mL de tampón de clasificación (J) y se centrifugaron a 300 x g durante 10 min a 4 °C. (K) Se retiró el sobrenadante y el pellet se resuspendió cuidadosamente en 8 mL de tampón de clasificación. (L) A continuación, inicie el programa POSSEL en el separador para preparar las columnas. Las células se transfirieron 1 mL por 1 mL en la columna, y las células CD11b se eluyeron en una placa de elución estéril con 1 mL de tampón de clasificación. (M) Las células CD11b se agruparon en un nuevo tubo de 50 mL y se centrifugaron a 300 x g durante 10 min a 4 °C, y se eliminó el sobrenadante. (N) El pellet se resuspendió cuidadosamente en 10 mL de medio de microglía frío en el último paso. Las células se contaron y diluyeron en el medio microglial hasta una concentración final de 650.000-700.000 células/mL dispensadas en placas de cultivo celular.