Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Inyección intracisternal de ratones
NOTA: Todo el procedimiento se realiza en la cabina de flujo laminar para mantener las condiciones asépticas.
- Ratones de laboratorio domésticos (8 semanas de edad, hembra Balb/c) en condiciones específicas libres de patógenos. Proporcionar gránulos de comida y agua ad libitum.
- Coloque a los animales en el nuevo entorno durante 1 semana antes de comenzar el experimento.
- Antes de comenzar el experimento, pesa y evalúa su temperatura corporal.
nota: Los ratones hembra consanguíneos Balb/c de ocho semanas de edad pesan una media de unos 19 g. La temperatura media de los ratones de laboratorio oscila fisiológicamente entre 36 y 38 °C.
- Escorzar el pescuezo del animal, limpiar la zona del abdomen con etanol al 70% e inyectar dextrano hierro I.P. (disuelto en tampón salino fosfato al 1%, 250 mg/kg) en el cuadrante inferior derecho del abdomen murino utilizando una aguja de 25 G de 0,5 mm x 16 mm, aproximadamente 2-3 h antes de la infección
nota: La inyección intraperitoneal se realizó en el cuadrante inferior derecho del abdomen murino para evitar dañar órganos abdominales como la vejiga urinaria, ciego, etc. La administración de una fuente exógena de hierro, en forma de hierro dextrano, a los animales antes de la infección favorece la multiplicación bacteriana en el huésped.
- Después de 2-3 h, realizar anestesia animal con ketamina (50 mg/kg) y xilacina (3 mg/kg), y lubricante oftálmico.
- Verifique la profundidad de la anestesia asegurándose de que no haya respuesta al dolor al pellizcar el dedo del pie.
- Coloque al ratón en decúbito esteral y estire con cuidado las extremidades y la columna cervical para mantener la columna vertebral en posición recta.
- Mezcle suavemente la suspensión bacteriana para mantener una suspensión consistente antes de cargar una jeringa de aguja de 30 G x 8 mm.
nota: Prepare la suspensión bacteriana lo más cerca posible del momento de la inyección; Mientras tanto, guárdelo a temperatura ambiente.
- Sobre la base del título bacteriano posterior a la descongelación (UFC/mL), se procede al cálculo de las UFC totales a utilizar, con respecto al número total de animales a infectar (dosis bacteriana de UFC por número de animales). Proceda con el cálculo del volumen exacto que se debe tomar del vial para obtener la UFC total aplicando una proporción entre el título bacteriano post-descongelación (UFC/mL) y el UFC total útil para la infección de n ratones (ufc bacteriana post-descongelación: ml = UFC totales: x). Establecer el volumen final con respecto al número total de animales a infectar.
nota: En estos experimentos, se utilizó una amplia gama de títulos de 104 a 109 por animal.
- Limpie el área quirúrgica con etanol al 70%.
- Identifique el punto de inyección con la ayuda de una aguja e inyecte la UFC establecida de meningococos (cepa salvaje y cepa mutante isogénica), o caldo de GC suplementado con hierro dextrano (5 mg/kg) como control, en un volumen total de 10 μL en la cisterna magna de ratones a través de un orificio de rebaba occipital utilizando una aguja de 30 G x 8 mm.
- Realizar el inóculo cisternal colocando la aguja en la unión craneocervical, concretamente en el espacio subaracnoideo dorsal. Ventroflex la cabeza para hacer accesible este espacio.
- Brevemente, coloque al animal en decúbito lateral, mantenga las orejas fuera del camino y flexione el cuello moderadamente (90 a 100°). Asegúrese de que la línea media del cuello y la cabeza (desde la nariz hasta el occipucio) estén en una posición perfectamente paralela a la mesa.
- Toque las alas del atlas y asegúrese de que se superpongan, eliminando la rotación axial. Por lo general, se puede tocar una hendidura natural en la línea media, donde es más probable que la aguja ingrese al orificio occipital.
- Deseche la jeringa y la aguja de forma segura después de la inyección de Neisseria en ratones.
- Coloque al animal en la jaula y espere el despertar y la recuperación completa del movimiento.
- Mantenga las jaulas con ratones infectados bajo una cabina de flujo laminar.
- Monitorizar ratones, 24 h después de la infección, para detectar signos clínicos de coma según la escala de coma. Escala de coma: 1 = coma, 2 = no se mantiene erguido después de ser volteado boca arriba, 3 = se mantiene erguido dentro de los 30 s, 4 = se mantiene erguido dentro de los 5 s, actividades ambulatorias mínimas, 5 = normal.
nota: Cuando se registró dolor en animales, se administró analgesia con meloxicam (5 mg/kg i.p. durante todo el estudio).
>2. Supervivencia de los animales y recuentos de UFC
- Supervivencia animal
- Preparar inóculos bacterianos a diferentes dosis (que van desde 104 a 109 UFC por ratón) para infectar animales por la vía i.cist.
- Inocular a los ratones de control con caldo de GC, suplementado con hierro dextrano (5 mg/kg), de la misma manera.
- Monitoree a los animales para detectar síntomas clínicos: pelaje erizado, apariencia encorvada, hipotermia, pérdida de peso, letargo o moribundo todos los días durante todo el experimento durante 168 h (7 días) al menos dos veces al día durante la duración del experimento.
- Mida el peso corporal y la temperatura utilizando una balanza digital y un termómetro rectal, respectivamente, todos los días.
- Registre la supervivencia de los ratones durante una semana.
nota: Registrar la muerte natural del animal después de la infección, mientras que los animales que alcancen un valor de coma de 2 o que sobrevivan más de 168 h de observación serán sacrificados.
- Anestesiar ratones con un valor de coma de 2 o que sobrevivan durante el tiempo de observación con ketamina (50 mg/kg) y xilacina (3 mg/kg) y aplicar pomada oftálmica.
- Verifique que la respuesta al dolor esté ausente por un pellizco en el dedo del pie.
- Realizar la eutanasia de ratones por luxación cervical y registrarlos como muertos para su análisis estadístico.
- Proceda a realizar el ensayo de supervivencia o recuento de UFC en los animales infectados.