Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Fuente y carcasa del ratón
- Derivar ratones LysM-eGFP en un fondo genético C57BL/6J. Derivar ratones LysM-EGFP×MyD88-/- cruzando ratones LysM-EGFP con ratones MyD88-/- en un fondo C57BL/6J.
- Ratones domésticos en un vivero. Para estos estudios, los animales se alojaron en la Universidad de California, Davis, en grupos antes de la cirugía y en un solo alojamiento después de la cirugía. Utilice ratones de entre 10 y 16 semanas de edad.
>2. Preparación y cuantificación bacteriana
- Retire la cepa bioluminiscente de S. aureus de interés del almacenamiento a -80 °C para descongelarla en hielo. Raya en una placa de agar sangre bovina al 5%. Incubar la placa rayada en una incubadora humidificada a 37 °C durante la noche (16 h).
nota: En este protocolo se utilizó la cepa ALC2906 SH1000. Esta cepa contiene el plásmido lanzadera pSK236 con los promotores de la proteína 2 de unión a la penicilina fusionados con el casete reportero luxABCDE de Photohabdus luminescens.
- Prepare el caldo de soja tríptico (TSB) mezclando 0,03 g de polvo de TSB por ml de agua pura, y autoclave TSB para esterilizar. Cuando se enfríe, agregue los antibióticos necesarios mediante una técnica estéril. En este protocolo, se añaden 10 μg/mL de cloranfenicol al TSB para seleccionar la expresión del plásmido de lanzadera pSK236, que contiene el casete luxABCDE de bioluminiscencia.
- Escoja 3-4 colonias separadas de la placa de S. aureus en TSB con 10 μg/mL de cloranfenicol para iniciar un cultivo nocturno. Incubar las bacterias en un agitador de incubación a 37 °C durante la noche (16 h).
- Inicie un nuevo cultivo bacteriano a partir del cultivo nocturno diluyendo una muestra 1:50 en TSB con 10 μg/mL de cloranfenicol. Cultivo en agitador de incubación a 200 rpm y 37 °C.
- Dos horas después de dividir el S. aureus, controle la densidad óptica a 600 nm (OD600) en un espectrofotómetro. Observe el OD600 vs. el tiempo para encontrar el crecimiento de la fase logarítmica media. Para la ALC2906 cepa SH1000, un OD600 de 0,5 es logarítmico medio y corresponde a una concentración de 1 x 108 UFC/mL (Figura 1).
- Cuando el diámetro exterior de600 sea 0,5, lave las bacterias 1:1 con DPBS helado. Centrifugar las bacterias durante 10 minutos a 3.000 x g y 4 °C. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y añadir DPBS y vórtice refrigerados adicionales a fondo. Centrifugar una vez más durante 10 min a 3.000 x g y 4 °C.
- Decanta cuidadosamente el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet bacteriano a la concentración deseada. Para estos estudios, recoja 3 mL de ALC2906 SH1000 y vuelva a suspender en 1.5 mL de PBS, correlacionándose con una concentración de bacterias de aproximadamente 2 x 108 UFC/mL. Mantenga las bacterias en hielo hasta su uso.
- Para verificar la concentración de bacterias, diluir 100 μL de la muestra bacteriana 1:10.000 y 1:100.000 en PBS. Placa de 20 μL de alícuotas en una placa de agar. Incubar a 37 °C en una incubadora humidificada durante 16 h. Cuente las UFC mediante un examen macroscópico y calcule una concentración bacteriana al día siguiente.
>3. Escisión de la piel e inoculación con S. aureus
- Administrar 100 μL de clorhidrato de buprenorfina (~0,2 mg/kg) a cada ratón mediante inyección intraperitoneal.
- Veinte minutos después de la inyección, coloque 2-4 ratones en una cámara con 2-3 LPM de oxígeno con 2-4% de isoflurano. Una vez que los ratones estén completamente anestesiados, transfiéralos uno a la vez a un cono de nariz conectado a 2-3 LPM de oxígeno con 2-4% de isoflurano. Verifica que los ratones estén completamente anestesiados pellizcando firmemente cada pata trasera entre el pulgar y el índice. Continúe con el siguiente paso si el animal no responde al pellizco.
- Afeita una sección de 1 pulgada por 2 pulgadas en la parte posterior del mouse con una maquinilla eléctrica y despeja el área de recortes de piel con una toallita limpia o una gasa. Evite usar loción depilatoria porque puede causar un exceso de inflamación.
- Limpie la parte posterior del ratón primero con una gasa empapada en povidona al 10% y luego con una gasa empapada en etanol al 70%. Limpie el área en forma de espiral, moviéndose hacia afuera desde el centro del área quirúrgica. Espere aproximadamente 1 minuto para que el área quirúrgica se seque antes de la cirugía.
- Sostenga la parte posterior afeitada del ratón sin apretar entre dos dedos y presione firmemente una biopsia estéril con sacabocados de 6 mm en el centro del área quirúrgica preparada. No tire de la piel para tensarla.
- Retuerce la biopsia con sacabocados para crear un contorno circular en la piel que corte completamente la piel en al menos una sección del contorno. Tenga cuidado de no cortar la fascia o el tejido subyacente.
- Use tijeras y pinzas estériles para cortar la epidermis y la dermis siguiendo el patrón circular impreso por la biopsia con sacabocados.
>4. Inoculación de S. aureus
- Llene una jeringa de insulina de 28 G con el inoculante bacteriano bioluminiscente deseado. En este estudio, administre una concentración de 1 x 108 UFC/mL (50 μL). No administrar más de 100 μL de volumen.
- Inyecte 50 μL de inoculante entre la fascia y el tejido en el centro de la herida en la parte posterior del ratón. Asegúrese de que el inoculante forme una burbuja en el centro de la herida con una fuga o dispersión mínima.
- Tire de la dermis hacia un lado, sostenga la jeringa casi paralela al tejido y empuje lentamente la jeringa dentro del tejido hasta que se sienta una disminución repentina de la resistencia, lo que indica una perforación de la fascia. Lleve con cuidado la jeringa al centro de la herida y dispense el inoculante lentamente. Retire la jeringa lentamente del animal.
- Inyectar el mismo volumen de PBS estéril en las heridas de los animales no infectados que se ha descrito anteriormente.
- Regrese al animal a su jaula. Coloque la jaula debajo de una lámpara de calor o encima de una almohadilla térmica y controle al animal hasta que se recupere de la anestesia.
5. En vivo BLI y FLI
- Inicialice todo el generador de imágenes de animales a través del software del instrumento. Anestesiar ratones en una cámara que recibe 2-3 LPM de oxígeno con 2-4% de isoflurano. Administre anestesia a los conos de la nariz dentro del generador de imágenes.
- Coloque el ratón herido e infectado en el generador de imágenes. Coloque el ratón de manera que la herida quede lo más plana posible. Utilice la siguiente configuración de secuencia para obtener imágenes de los ratones.
- Seleccione Luminiscencia y Fotografía como modo de imagen. El tiempo de exposición es de 1 min en binning pequeño y F/stop 1 (luminiscencia) y F/stop 8 (fotografía). El filtro de emisiones está abierto. Haga clic en el botón Adquirir para grabar la imagen.
- Seleccione Fluorescencia y Fotografía como modo de imagen. El tiempo de exposición es de 1 s en agrupación pequeña y F/stop 1 (fluorescencia) y F/stop 8 (fotografía) con una longitud de onda de excitación de 465/30 nm y una longitud de onda de emisión de 520/20 nm con una alta intensidad de lámpara. Haga clic en el botón Adquirir para grabar la imagen.
- Regrese al animal a su jaula y vigílelo hasta que se recupere de la anestesia.
- Imagine los ratones diariamente como se describe anteriormente.
>6. Análisis de imágenes
- Abrir imágenes para cuantificar.
- Coloque una gran región circular de interés (ROI) sobre toda el área de la herida, incluida la piel circundante para cada ratón en la imagen. Las señales de FLI EGFP in vivo de neutrófilos y BLI in vivo de S. aureus se extienden más allá del borde de la herida después de varios días y se incluyeron en estos estudios (Figuras 2A y 2B). Haga clic en Medir el ROI y registre los valores del flujo medio para cada ratón. Representa el flujo medio de cada señal (p/s) en función del tiempo.
- Si se desea un número absoluto de neutrófilos o S. aureus en la herida, realice los siguientes experimentos.
- Para correlacionar el número de neutrófilos con las señales in vivo de FLI EGFP, se heriron ratones C57BL/6J como se describió anteriormente y se transfirieron una variedad de neutrófilos derivados de la médula ósea (5 x 105 a 1 x 107) de donantes LysM-EGFP o LysM-EGFPxMyD88-/- directamente sobre diferentes heridas. Imagen como se describe anteriormente y correlacionar las señales in vivo de FLI EGFP con la cantidad conocida de neutrófilos.
- Para correlacionar S. aureus CFU con las señales BLI in vivo, hiera e infecte ratones como se describe anteriormente. El día 1, después de la infección, registre in vivo las señales BLI de los ratones y eutanasie y enfríe inmediatamente los cadáveres. Extirpar la herida, homogeneizar el tejido y colocar diluciones bacterianas en agar para la incubación durante la noche. Al día siguiente, cuente las colonias para determinar las UFC por herida.
- Para medir la cicatrización de la herida, coloque un ROI circular sobre el borde de la herida y mida el área de la herida (cm2) y trace el cambio fraccional desde el inicio hasta el tiempo (Figura 2C).
