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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Inducción de inflamación de la superficie ocular murina
- Realizar la preparación del inmunógeno para la inmunización.
- Prepare el inmunógeno fresco el día de la inmunización, mezclando ovoalbúmina (OVA, 50 mg/mL) y toxina de tos ferina (100 μg/mL) en solución salina y el adyuvante hidróxido de aluminio (40 mg/mL) (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:1.
cautela: Realizar la apertura, reconstitución y preparación inmunógena de la toxina pertussis en una cabina de seguridad laminar. Use ropa protectora y evite cualquier contacto con la piel.
- Incubar la mezcla de inmunógenos y adyuvantes a temperatura ambiente durante 30 min y cargar 100 μL en una jeringa de 1 mL.
- Realizar la inyección intraperitoneal de la solución de inmunógeno en un ratón no anestesiado.
- Sostenga el mouse suavemente por la cola mientras agarra la rejilla de la jaula. Sujete firmemente la piel de la espalda y la región del cuello entre el pulgar y el índice y fije la cola y las extremidades inferiores entre el dedo anular y el meñique contra la palma de la mano.
- Mantenga el mouse fijo con la cabeza hacia abajo.
- Inyecte 100 μL de la solución inmunogénica preparada en el cuadrante derecho o izquierdo de la cavidad abdominal inferior.
- Realizar la provocación de la superficie ocular 2 semanas después de la vacunación.
- Anestesiar al ratón con isoflurano (2,5%).
- Aplique 5 μL de OVA (50 mg/mL) o solución salina (0,9 % de NaCl) por ojo en ambos ojos y espere hasta que la gota sea absorbida por el ojo. Esto tarda ~5 min.
- Repita el procedimiento 1 vez al día durante 7 días.
nota: La administración tópica de medicamentos se puede hacer de la misma manera.
>2. Recolección de exudados oculares
- Recuperar los exudados oculares formados durante la fase de provocación aplicando 50 μL de suero fisiológico estéril en el ojo inmediatamente después de la promina.
>3. Escisión de los tejidos de la superficie ocular
- Disecciona los párpados y el globo ocular siguiendo los pasos que se indican a continuación.
- Eutanasia del ratón por asfixia con CO2 y luxación cervical.
- Coloque el mouse sobre una superficie uniforme.
- Desinfecte el área orbital alrededor del ojo con un hisopo impregnado con etanol al 70%.
- Hacer una incisión entre la oreja y el seno retroorbitario y a lo largo de la superficie por encima del hueso escamoso verticalmente, extendiendo la incisión horizontalmente por debajo del párpado inferior a lo largo del hueso maxilar y por encima del párpado superior a lo largo del hueso frontal. Esto forma una incisión alrededor del ojo (Figura 1).
- Sostenga con cuidado el tejido diseccionado alrededor del ojo con pinzas curvas y extraiga el tejido y el globo ocular.
- Coloque los órganos extirpados en PBS estéril.
- Recorte el exceso de tejido muscular facial alrededor de los párpados superiores extirpados con un bisturí y bajo el microscopio estereoscópico.
- Recoja la conjuntiva siguiendo los pasos a continuación.
- Coloque el párpado superior sobre una placa de Petri seca bajo el microscopio estereoscópico.
- Con unas pinzas finas y un bisturí, retire la capa mucosa blanquecina muy suavemente de la superficie interna del párpado.
- A continuación, disecciona la córnea siguiendo los pasos que se indican a continuación.
- Coloque el globo ocular en una nueva placa de Petri seca sobre hielo seco durante 3 minutos.
- Coloque la placa de Petri en la superficie del banco en una posición estable.
- Haga una pequeña incisión en el borde de la córnea junto al limbo con unas tijeras finas y afiladas.
- Prolongue la incisión con el bisturí alrededor del globo ocular, separando la esclerótica de la córnea.
- Retire los restos del iris y el cristalino de la parte posterior de la córnea enjuagando generosamente con solución salina.
