Identificación de inhibidores de la quinasa que modulan la respuesta de los timocitos a señales fuertes de TCR

Resumen

Fuente: Chen, E. W., et al. Identificación de mediadores de la señalización del receptor de células T mediante el cribado de bibliotecas de inhibidores químicos. J. Vis. Exp. (2019).

En este video, describimos un método para identificar los inhibidores de quinasas de moléculas pequeñas que modulan la apoptosis de timocitos inmaduros CD4⁺CD8⁺ doblemente positivos autorreactivos. La apoptosis se induce en los timocitos dobles positivos activándolos con perlas magnéticas recubiertas de anti-CD3 y anti-CD28; A continuación, se realiza un tratamiento con inhibidores de moléculas pequeñas y un análisis de citometría de flujo para detectar si los inhibidores modulan la expresión del marcador apoptótico.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Cribado de la biblioteca de inhibidores de quinasas (ensayo independiente de la centrífuga)

1. Tratamiento de los timocitos con inhibidores de la cinasa
   1. Prepara una suspensión de timocitos.
   2. Diluir los timocitos en RPMI completo para obtener una suspensión de timocitos de 25 x 10⁶ células/mL.
   3. Añada 40 μl de timocitos a cada pocillo de una placa de pequeño volumen, utilizando una pipeta multicanal. Coloque el plato sobre hielo.
   4. Diluir los inhibidores de la placa madre, DMSO y dexametasona en RPMI completo en una proporción de cuatro partes de RPMI completo por una parte de inhibidor/DMSO/dexametasona (factor de dilución de 5).
      nota: Como los volúmenes utilizados en esta placa de pequeño volumen son 5 veces más pequeños que en el método convencional, los inhibidores y los reactivos de control se diluyen cinco veces antes de añadirlos a los timocitos de la placa.
   5. Añada 0,5 μL de inhibidores de cinasa a la placa de 96 pocillos desde los pocillos correspondientes de la placa inhibidora preparada en el paso 1.1.4.
   6. Prepare ocho pocillos de controles sin tratar. Prepare cuatro pocillos de controles tratados con vehículos añadiendo 0,5 μl del DMSO preparado en el paso 1.1.4. Prepare cuatro pocillos de 5 μM de controles tratados con dexametasona, utilizando la dexametasona diluida preparada en el paso 1.1.4 (Figura 1).

>2. Estimulación de timocitos mediante perlas anti-CD3/CD28

1. Asegúrese de que las cuentas se vuelvan a suspender de manera uniforme. Tome 1 mL de perlas y lávelas con 2 mL de PBS. Separe las perlas con un soporte magnético y aspire la solución. Vuelva a suspender las perlas en 1 mL de RPMI.
   nota: La proporción de cuentas a celdas es de 1 a 2,5. Ajuste la cantidad de perlas, en función del número de pocillos a estimular y del número de timocitos utilizados.
2. Agregue 10 μL de suspensión de perlas a cada muestra tratada con inhibidor, las cuatro muestras tratadas con DMSO y cuatro de las ocho muestras no tratadas. Agregue 10 μL de RPMI completo a los cuatro pocillos restantes sin tratar. La Figura 1 muestra la disposición general de las placas.
   nota: El volumen final de los pozos es de 50 μL, que está dentro de la capacidad máxima de los pozos. Es importante tener precaución y mantener las placas en posición vertical, para evitar derrames cruzados de pocillos.
3. Para mezclar, agite la placa con un agitador orbital de microplacas. Alternativamente, mezcle el contenido de los pocillos con una pipeta multicanal.
4. Incubar los timocitos en una incubadora a 37 °C, 5% de_CO2 durante 17 - 20 h (o toda la noche) con tapa antievaporación.

3. Configuración de la lavadora de placas

NOTA: Las instrucciones para configurar la arandela de placas son proporcionadas por el fabricante. Los pasos se mencionan brevemente a continuación. Se necesitan aproximadamente 150 ml de solución para cada paso de cebado.

1. Prepare el sistema de lavado con un 70% de etanol que contenga un 1% de Tween 20.
2. Prepare el sistema de lavado con agua desionizada que contenga un 1% de Tween 20.
3. Prepare el sistema de lavado con tampón de lavado FACS.

>4. Tinción de antígenos de superficie

1. Prepare una mezcla de tinción de anticuerpos que contenga anticuerpos anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 y anti-CD69. Diluir los anticuerpos en el tampón de lavado FACS en una proporción de 1:100 (v/v).
2. Lave la placa 9 veces, utilizando 55 μL de tampón de lavado FACS por lavado, utilizando el sistema automatizado de lavado de flujo laminar.
   nota: Al final de los lavados, habrá 25 μL de volumen residual en cada pocillo.
3. Vuelva a suspender las células en 25 μL de la mezcla de anticuerpos de tinción preparada en el paso 1.4.1.
4. Si las muestras se transfieren desde una placa de 96 pocillos, vuelva a suspender las células en 50 μL de la mezcla de anticuerpos y transfiera las muestras a la placa de pequeño volumen. Este paso corresponde al método número 2, como se muestra en la Figura 2A.
5. Para mezclar, agite la placa con un agitador orbital de microplacas o mezcle las muestras con una pipeta multicanal e incube en hielo durante 30 min.

>5. Fijación de células

1. Lave la placa 9 veces, utilizando 55 μL de tampón de lavado FACS por lavado, utilizando el sistema automatizado de lavado de flujo laminar.
2. Añadir tampón de fijación/permeabilización (viene con el kit de apoptosis de caspasa-3 activo; lo mismo con el tampón de permeabilidad/lavado 10x mencionado en el paso 1.6.1 y el anticuerpo anti-caspasa-3 en el paso 1.6.2) a 50 μL por pocillo.
3. Incubar en hielo durante 30 min.

>6. Tinción intracelular para caspasa activa 3

1. Prepare 1x tampón de permanente/lavado diluyendo 25 mL de 10x tampón de permanente/lavado en 225 mL de agua ultrapura.
2. Prepare la tinción de caspasa activa intracelular añadiendo 1 mL de anticuerpo anti-caspasa-3 a 2 mL de tampón 1x permanente/lavado. La relación entre el anticuerpo y el tampón de permanente/lavado es de 1:2.
3. Prepare el sistema de lavado con 1x tampón de permanente/lavado.
4. Lave la placa 9 veces con 1x tampón de permanente/lavado, a 55 μL por cada lavado.
5. Añadir 25 μL de la tinción de caspasa intracelular preparada en el paso 1.6.2 a todos los pocillos.
6. Para mezclar, agite la placa con un agitador orbital de microplacas o mezcle las muestras con una pipeta multicanal e incube en hielo durante 1 h.
7. Lave la placa 9 veces con 1x tampón de permanente/lavado, a 55 μL por cada lavado.
8. Agregue 25 μL de tampón de lavado FACS a todos los pocillos.
9. Transfiera las muestras a tubos de microtitulación después de una mezcla adecuada mediante pipeteo.
10. Añadir otros 50 μL de tampón de lavado FACS a los pocillos vacíos y repetir el paso 1.6.9.
11. Repita los pasos 1.6.9 y 1.6.10 2x hasta que se recojan 200 μL de las muestras en los tubos de microtitulación.
    nota: El propósito de los procedimientos descritos en los pasos 1.6.10 y 1.6.11 es asegurar la máxima recuperación de las células de la placa de pequeño volumen. Si el número de células no es un problema, después del paso 1.6.10, simplemente rellene los tubos de microtitulación a 200 μL con tampón de lavado FACS.
12. Ejecute un análisis de citometría de flujo de las muestras y analice los resultados con un programa de análisis FACS. La activación de la caspasa-3 y la expresión de CD69 se analizan en la puerta que contiene timocitos CD4+CD8+DP.

Resultados

Figura 1: Disposición de la placa del ensayo de activación de timocitos. (Arriba) Las columnas 1 y 12 están reservadas para los controles, mientras que las columnas 2 a 11 son muestras tratadas con inhibidores (beige). El control negativo (no estimulado [NS]; gris) ocupa los pocillos A1 a D1, y el control positivo para la muerte celular (tratado con dexametasona [DEX]; morado) ocupa los pocillos E1 a H1. Las columnas 2 a 12 contiene...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI	HyClone	SH30027FS
FBS	HyClone	SH3007103
L-Glutamina	HyClone	SH3003401
Piruvato de sodio	HyClone	SH3023901
10 veces PBS	Vivantis	PB0344 – 1L
Biblioteca de detección de quinasas (96 pocillos)	Química de las Islas Caimán	10505	El contenido exacto de la biblioteca puede variar
Dmso	Sigma Aldrich	D2650
dexametasona	Sigma Aldrich	D4902
perlas anti-CD3/CD28	Thermo Fisher Scientific	11452D
Kit de apoptosis FITC Active Caspasa-3	BD Pharmingen	550480	Contiene tampón de fijación/permeabilización, tampón 10X Perm/Wash y anticuerpo anti-caspasa 3
Lavadora DA-Cell	CURIOX	HT1000
Placa de celda DA de 96 pocillos	CURIOX	96-DC-CL-05
anticuerpos
CD3e	BioLeyenda	100236
TCRb	BD Biociencias	553174
CD4	BD Biociencias	740007
CD8	BD Biociencias	563786
CD69	eBiociencia	25-0699-42
Inhibidores
TG003	Química de las Islas Caimán		De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
TG003	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
PKC 412	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Doramapimod	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Paclitaxel	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Erlotinib	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Necrostatina-5	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
NVP-BEZ235	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Ftalazinona pirazol	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-879	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
1-NA-PP1	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Torín 1	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Bisindolilmaleimida II	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
BIBF 1120	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SMI-4a	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Bisindolilmaleimida XI (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10657	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AS-703026	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Cloruro de queleritrina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Tunicamicina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
GSK 1059615	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Ruxolitinib	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Necrostatina-1	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SB 505124	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
INK128	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Canertinib (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SB 431542	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
PD 173074	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Ácido valproico (sal de sodio)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
PD 0325901	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SB 203580	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
VX-702	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Emodina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CHIR99021	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
bio	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Imatinib (mesilato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Sunitinib Malato	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Gefitinib	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
PP2	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
3-Metiladenina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Bisindolilmaleimida I	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Bisindolilmaleimida IV	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Bisindolilmaleimida V	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
NSC 663284	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
D 4476	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
NU 7026	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
H-9 (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Indirubina-3'-monoxima	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
KN-62	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
KN-93	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CGP 57380	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Iso-olomoucina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
(S)-Glycyl-H-1152 (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Bisindolilmaleimida VIII (acetato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
ST638	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SU 6656	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
LY364947	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SB 203580 (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10621	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
YM-201636	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
ZM 447439	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AS-041164	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
NVP-AEW541 (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
PP242	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
ABT-869	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10622	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
17β-hidroxi Wortmannina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10626	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SU 6668	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10572	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
N,N-dimetilesfingosina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
LY294002	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
U-0126	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Staurosporina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
KN-92 (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AS-605240 (sal de potasio)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
O-1918	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Y-27632 (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Leelamina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
PD 98059	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
PD 169316	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
TGX-221	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
(S)-H-1152 (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AS-605240	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
D-eritro-esfingosina C-18	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
OSU03012	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
JNJ-10198409	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Leelamina (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Leelamida de ácido araquidónico	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Leelamida de ácido láurico	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AS-252424	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10505	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
PI-103	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
PIK-75 (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Inhibidor de la esfingosina quinasa 2	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Piceatannol	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SC-1	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
(R)-Roscovitina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
BAHÍA-43-9006	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10561	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AS-604850	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Inhibidor de la α PI3-quinasa 2	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
ML-9	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Triciribina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Análogo de la erbstatina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Kenpaullone	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Olomoucine	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-494	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-825	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-1478	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SB 216763	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SB 415286	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-17	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
H-8 (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
LFM-A13	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SC-514	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Apigenina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-18	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10554	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
DRB	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
RG-13022	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
RG-14620	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-490	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-82	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-99	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-213	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-183	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Lavendustin C	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
ZM 336372	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
5-Yodotubercidina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SB 202190	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10571	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Nilotinib	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
SP 600125	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
L-treo-esfingosina C-18	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
H-89	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
HA-1077 (clorhidrato)	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-370	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Wortmannin	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
AG-1296	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
KT 5823	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Janex 1	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10574	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10575	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10576	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
NH125	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
TWS119	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
NSC 210902	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10577	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CAY10578	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
PD 184161	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
CCT018159	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas
Miricetina	Química de las Islas Caimán	-	De la Biblioteca de Cribado de Quinasas