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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Derivación y activación de macrófagos de médula ósea con anticuerpos
- Realizar la eutanasia mediante asfixia con CO2.
- Coloque el mouse en la cámara de inducción. Eutanasiar al ratón con anestesia con isoflurano al 5%, durante 60 a 90 s, hasta que esté inmóvil y la respiración sea profunda y lenta.
- Apague la anestesia con isoflurano y administre de 6 a 8 L/min de CO2 hasta que el ratón haya dejado de respirar. Deje el ratón con CO2 activado durante al menos otros 5 minutos. Verifique que ya no haya latidos del corazón ni respiración. Realizar una luxación cervical para asegurar la muerte.
NOTA: Los ratones de 8 a 12 semanas de edad proporcionan el mayor rendimiento de macrófagos.
- Rocíe las patas del ratón con etanol al 70% y sujételas con los brazos y las piernas estirados en posición supina sobre una tabla de espuma. Con unas tijeras y pinzas para sujetar la piel, haga un corte poco profundo (0,2 cm) para quitar la piel y el pelaje de la superficie de cada una de las patas traseras.
nota: Realice este procedimiento y todas las manipulaciones de cultivo de tejidos en una campana estéril.
- Recorta el músculo para que las tibias y los fémures sean visibles. Extirpa las tibias y los fémures, cortando el hueso y los músculos justo debajo de la articulación de la cadera y por encima de los tobillos. Recorta la mayor cantidad de músculo posible.
- Rocíe los huesos con etanol al 70% y espere 1 minuto a que se evapore, luego colóquelos en una placa de 6 pocillos de medio de lavado de hueso (medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), suero bovino fetal al 10% (FBS)).
- Recorte los extremos de los huesos cortando 0,1 cm de hueso del tobillo y la parte superior del fémur para que la cavidad ósea quede expuesta. Asegúrese de que la médula esté visible y de que se pueda colocar una aguja de calibre 26 en la cavidad ósea.
- Corta los huesos y los músculos para separar las tibias y los fémures de las articulaciones de la rodilla. Inserte una aguja de calibre 26 conectada a una jeringa de 10 ml en la cavidad. Enjuague la médula ósea en un tubo cónico de 50 mL con 5 mL de medio de lavado óseo. Enjuague dos tibias y dos fémures, de un ratón, en cada tubo de 50 ml.
- Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces o agitar la médula a una velocidad lenta para dispersar suavemente los grumos. Los hilos de médula deben dividirse en pequeñas motas de médula (menos de 0,5 mm). Llene el tubo cónico hasta 50 mL con el medio de lavado de hueso. Pipetear el contenido del tubo cónico en un matraz tratado con cultivo de tejidos de 75cm2 e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 1 h.
nota: Los macrófagos maduros y las células mesenquimales se adherirán al matraz y se descartarán, mientras que los progenitores hematopoyéticos deseados permanecerán en suspensión.
- Pipetear el medio con progenitores hematopoyéticos en un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar el tubo a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 5 mL de medio de cultivo de factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF) (IMDM, FBS al 10%, 5 ng/mL de MCSF, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina y 150 μM de monotioglicerol (MTG)).
- Cuente las células con un hemocitómetro. Añada medio para resuspender las células a una concentración de 0,5 x 106 células/ml, 1,5 x 107 células/matraz en 30 ml de medio y pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente. Pipetear 30 mL de suspensión en un nuevo matraz de 75cm2 tratado con cultivo de tejidos.
- El día 4 y el día 7 después del cultivo inicial en el paso 1.9, verifique que las células estén adherentes y ligeramente ramificadas utilizando un microscopio de campo claro con contraste de fase invertida. Deseche el medio que contiene las células no adherentes. Lave las células con IMDM una vez y agregue 30 mL de medio de cultivo MCSF.
- Cuando las células estén maduras para el día 10 (>95% positivo para F4/80 y Mac-1), verifique de nuevo que las células estén adherentes y ligeramente.
- Para colocar las células en placas para la estimulación, retire el medio de cultivo del matraz y agregue 8 mL de tampón de disociación celular sin enzimas a base de EDTA (Tabla de materiales). Incubar las células durante 5 min a 37 °C, 5% de CO2.
- Raspe las células suavemente, con una pequeña cantidad de presión, usando un raspador de células estéril. Compruebe en el microscopio que las células se han desprendido de la superficie del matraz. Pipetea las células disociadas en un tubo cónico de 50 mL. Enjuague el matraz 3 veces con 5 mL de IMDM y mezcle la solución de enjuague con las células que se recolectaron. Centrifugar las celdas a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 min.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 3 mL de medio de cultivo MCSF por tubo cónico de 50 mL. Cuente las células viables con un hemocitómetro. Resuspender las células a una concentración de 1 x 106 células/mL y colocar una placa de 100 μL de suspensión celular (1 x 105 células/pocillo) por pocillo de un cultivo de tejido tratado con 96 pocillos, placa de fondo plano.
nota: Los huesos de un ratón generarán suficientes células para 100 pocillos. Si se desea, se puede sembrar 1 mL de células en una placa de 6 pocillos (tratamiento con cultivo de tejidos, fondo plano). Un mayor número de células (1 x 10,6 células) puede ser útil para los análisis de Western blot.
- Una vez adherido, estimule los pocillos duplicados o triplicados, cada uno con 10 ng/mL de LPS en IMDM, 30 mg/mL de IVIg o IVIg + LPS. Las dosis de LPS o IVIg se pueden ajustar para optimizar las respuestas. Deje los pocillos duplicados o triplicados como controles no estimulados. Incubarlos durante 24 h (37 °C, 5% CO2).
nota: Las células replantadas deben adherirse a los pocillos de cultivo de tejidos en 1 h.
- Recoja los sobrenadantes celulares de cada pocillo en tubos individuales de microcentrífuga de 1,7 ml y elimine las partículas girando a 10.000 x g durante 5 minutos.
- Retire el sobrenadante de la célula y evite perturbar el pellet. Coloque el sobrenadante celular clarificado en un tubo de microcentrífuga estéril.
nota: Los sobrenadantes celulares pueden analizarse para detectar citocinas, IL-10, y la subunidad de citocinas, IL-12/23p40, mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) de forma inmediata o almacenarse a -80 °C a largo plazo. Siga el protocolo ELISA de un kit disponible comercialmente (Tabla de materiales). Se pueden ensayar otras citocinas proinflamatorias, como la IL-6 y el TNF, ya que también se reducen con el tratamiento conjunto con estimulación con IVIg + LPS en comparación con la estimulación con LPS solo. Después de la estimulación, las células adherentes pueden prepararse para técnicas como el western blot o la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR).