Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Desafiando a ratones in vivo con inmunoglobulina intravenosa y lipopolisacárido (IVIg+LPS) y cosechando macrófagos peritoneales
- Pesa cada ratón. Calcular el volumen de IVIg (concentración de stock de 100 mg/mL) necesario para proporcionar una dosis final de 2,5 g/kg de peso corporal. Calcule la cantidad de LPS (concentración de stock de 100 μg/mL en el medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM)) necesaria para proporcionar una dosis final de 0,2 μg/g de peso corporal.
nota: Por ejemplo, para un ratón de 20 g, se requieren 500 μL de solución madre IVIg y 40 μL de una solución de 100 μg/mL de LPS.
- Extraiga la cantidad requerida de IgIV y LPS en una jeringa estéril de 1 ml equipada con una aguja estéril de calibre 26. En el caso de los ratones de control que no recibirán GbIV, reemplace un volumen equivalente de IgIV con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4.
- Golpea al ratón con una mano agarrando su piel por la parte posterior del cuello con el pulgar y el índice y sosteniendo su cola y patas traseras con los dedos restantes. Inclina su cuerpo hacia el suelo.
- Coloque la aguja en un ángulo de 30 a 40° con respecto al abdomen del ratón, en el cuadrante inferior derecho, biselada hacia arriba e inserte 1,5 cm. Inyecte el IVIg + LPS, o PBS + LPS, por vía intraperitoneal.
- Después de 1 hora, realizar la eutanasia mediante asfixia con dióxido de carbono (CO2).
- Coloque el mouse en una cámara de inducción. Eutanasiar al ratón con anestesia con isoflurano al 5%, durante 60 a 90 s, hasta que esté inmóvil y la respiración sea profunda y lenta.
- Apague la anestesia con isoflurano y administre 6-8 L/min de CO2 hasta que el ratón haya dejado de respirar. Deje el ratón con CO2 activado durante al menos otros 5 minutos. Verifique que ya no haya latidos del corazón ni respiración. Realizar una luxación cervical para asegurar la muerte.
NOTA: Los ratones de 8 a 12 semanas de edad proporcionan el mayor rendimiento de macrófagos.
- Sujeta el ratón a una tabla de espuma, con las extremidades extendidas. Rocíe las piezas con etanol al 70%
nota: Realice el procedimiento en una capucha estéril.
- Haga un corte poco profundo en la piel (0,2 cm) con unas tijeras a lo largo de la línea media del ratón, para evitar cortar la cavidad peritoneal. Retire la piel abdominal del vientre del ratón con fórceps, de modo que el revestimiento de la pared peritoneal intacta sea visible.
- Llene una jeringa de 5 mL con 5 mL de PBS estéril (pH 7,4). Inserte una aguja de calibre 25 o 27 en la parte superior de la cavidad desde el lado izquierdo o derecho hacia el centro del mouse con el bisel de la aguja hacia arriba.
nota: Coloque la aguja con cuidado en el ratón para que no inyecte PBS en los órganos, sino en el espacio peritoneal.
- Empuje el líquido hacia la cavidad peritoneal. Saque la aguja de la cavidad y masajee el peritoneo durante 10 segundos para desalojar las células. Inserte la aguja en la parte superior de la cavidad y evite los órganos. Recoja y coloque el líquido de lavado recuperado en un tubo cónico de 15 mL sobre hielo.
nota: Por cada 5 mL de líquido inyectado, se recuperarán aproximadamente 3,75 mL.
- Repita la inyección y la recuperación (pasos 1.8 - 1.9) 3 veces más (volumen total de inyección de 20 mL), para recuperar 15 mL de líquido de lavado en total. Recoja el lavado de cada ratón en un tubo cónico separado de 15 mL.
nota: Después de la inyección final, puede ser más fácil extraer el líquido de los extremos izquierdo y derecho del ratón, donde se ha acumulado líquido. Los órganos causarán menos interferencia con la aguja en esta posición.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Extraer 1 mL de líquido de lavado recuperado y utilizarlo para análisis de interleucina o IL-10 e IL-12/23p40 mediante ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) según las instrucciones del fabricante o congelar a -80 °C para análisis futuros.
nota: Para garantizar la comparación precisa entre los tratamientos para el análisis de citocinas del líquido de lavado, realice lavados de 5 mL de la cavidad peritoneal 4 veces para un volumen final de 15 mL. No todo el líquido se recuperará de cada descarga.
- Resuspender las células en 500 μL de medio de siembra (IMDM, 10% de suero fetal bovino, FBS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina) por ratón lavado. Recuento de macrófagos viables.
nota: Los macrófagos serán ligeramente más grandes que las otras células peritoneales. El rendimiento típico es de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/ratón utilizando un ratón C57BL/6 de tipo salvaje.
opcional: Si hay una gran cantidad de glóbulos rojos presentes en la pastilla de células, realice un paso de lisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante para eliminarlos.
- Vuelva a suspender las células en el medio de siembra a 1 x 106 macrófagos/mL y coloque 100 μL por pocillo en una placa tratada con cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos.
nota: Puede ser necesario agrupar células de más de un ratón para un experimento. Por ejemplo, si un ratón tuviera 5 x 105 macrófagos, se necesitarían 500 μL de medio de recubrimiento.
- Incubar las células durante 1 h a 37 °C, 5% de CO2 para permitir que los macrófagos se adhieran. Las células adherentes son los macrófagos peritoneales. Eliminar los sobrenadantes celulares y las células no adherentes. Enjuague los pocillos dos veces con 200 μL de IMDM (precalentado a 37 °C), espere 10 s e incline lentamente la placa. Reemplace el medio de recubrimiento. Incubar las células a 37 °C, 5% de CO2 durante 30 minutos antes de la estimulación.
- Una vez adherido, estimule los pocillos duplicados o triplicados, cada uno con 10 ng/mL de LPS en IMDM, 30 mg/mL de IVIg o IVIg+LPS. Las dosis de LPS o IVIg se pueden ajustar para optimizar las respuestas. Deje los pocillos duplicados o triplicados como controles no estimulados. Incubarlos durante 24 h (37 °C, 5% CO2).
nota: Las células replantadas deben adherirse a los pocillos de cultivo de tejidos en 1 h. Las muestras pueden utilizarse inmediatamente o congelarse y almacenarse a -80 °C para el análisis de citocinas mediante ELISA.
- Recoja los sobrenadantes celulares de cada pocillo en tubos individuales de microcentrífuga de 1,7 ml y elimine las partículas girando a 10.000 x g durante 5 minutos.
- Retire el sobrenadante de la célula y evite perturbar el pellet. Coloque el sobrenadante celular clarificado en un tubo de microcentrífuga estéril.
nota: Los sobrenadantes celulares pueden analizarse para detectar citocinas, IL-10, y la subunidad de citocinas, IL-12/23p40, mediante ELISA de inmediato, o almacenarse a -80 °C a largo plazo. Siga el protocolo ELISA del kit disponible comercialmente (Tabla de materiales). Se pueden ensayar otras citocinas proinflamatorias, como la IL-6 y el factor de necrosis tumoral (TNF), ya que también se reducen con el tratamiento conjunto con estimulación con IVIg+LPS en comparación con la estimulación con LPS solo. Después de la estimulación, las células adherentes pueden prepararse para técnicas como el western blot o la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR).
