Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Inmunización de ratones
- Prepare una mezcla maestra de vacunas en un tampón fisiológico estéril como solución salina o DPS.
nota: El volumen total de la mezcla debe incluir un 10% más que el requerido para la inmunización de todo el grupo. Las concentraciones de la composición de la vacuna se detallan a continuación en los pasos 1.1.1 y 1.1.2. Transporta los artículos al vivero en hielo.
- Para los estudios de B. pertussis, incluya los siguientes grupos de vacunas: vacuna acelular contra la tos ferina (aPV) y aPV + factor A de colonización por Bordetella (BcfA). Además, utilice alumbre, antígenos de la vacuna solos (hemaglutinina filamentosa (FHA) y pertactina (Prn)) y ratones naïve (no inmunizados) como grupos de control.
NOTA: aPV es 1/5de la dosis humana de un aPV aprobado por la FDA, que está compuesto por toxoide tetánico, toxoide diftérico reducido, toxoide de tos ferina (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA) y pertactina (Prn) adsorbida a sales de aluminio. Una dosis humana de la tos ferina aPV actual es de 0,5 mL, por lo tanto, 1/5 de una dosis es 0,1 mL. Los volúmenes de aPV + BcfA son 0,1 mL de aPV (1/5de la dosis humana) + 0,046 mL de BcfA (30 μg) por ratón. El volumen máximo que se puede administrar de forma segura a un músculo es de 0,1 ml. Debido a que el volumen de la vacuna aPV + BcfA es superior a 0,1 ml, la vacuna debe administrarse en ambos hombros, divididos aproximadamente en partes iguales, para que se administre de manera segura.
- Para preparar una vacuna experimental, para una dosis, combine 1 μg de FHA y 0,5 μg de Prn con 50 μg de gel de hidróxido de aluminio en PBS estéril. Deje que el aPV experimental se mezcle en un rodillo de laboratorio durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT). A continuación, gire el tubo a 18.000 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el contenido en 1 mL de PBS estéril.
- En el vivero, coloque la máquina de anestesia (Figura 1).
nota: Asegúrese de que haya niveles adecuados de oxígeno e isoflurano en sus respectivos tanques antes de su uso. Pese el bote del eliminador de isoflurano y reemplácelo cuando su peso aumente en 50 g.
- Limpie a fondo la cabina de seguridad biológica (BSC) y coloque la cámara de inducción limpia dentro del BSC. Conecte las líneas de anestesia y eliminador de la máquina de anestesia a la cámara de inducción. Abra el tanque de oxígeno a través del regulador para asegurarse de que el oxígeno fluya y ajuste el nivel a 1,5-2 L/min.
- Coloque los ratones de la edad deseada (6-12 semanas) en la cámara de inducción. Encienda el isoflurano al 2,5-3% para anestesiar ligeramente a los ratones. Vigile a los animales hasta que no se muevan en la cámara y su respiración se haya ralentizado.
- Pruebe el nivel de inducción pellizcando los dedos de los pies, observando cualquier movimiento reflejo. Si no hay ninguno, entonces los ratones están listos para inyectar.
NOTA: En este experimento, toda la jaula de los animales fue anestesiada a la vez. Se puede optar por anestesiar a los animales individualmente para inyectarlos o inyectar a los animales sin anestesia. Cualquiera de estos métodos es apropiado.
- Mientras tanto, prepare jeringas de insulina de 1 mL (28G1/2) con 0,1 mL de vacuna cada una. Cuando los animales estén completamente inducidos, retire un animal de la cámara y coloque al ratón ventralmente sobre una toalla o una almohadilla de banco.
- Administrar la vacuna por vía intramuscular. Con la jeringa en un ángulo de 45° y con el bisel hacia arriba, inserte la jeringa ~5 mm en el deltoides del ratón e inyecte la vacuna.
nota: El cuarto trasero/flanco se puede utilizar como sitio de inyección en lugar del deltoides.
- Después de la inyección, mantenga la aguja insertada en el músculo durante ~ 5-10 s. Una vez que se administre el volumen, gire la jeringa a 180° para que el bisel mire hacia afuera para crear un sello y evitar la fuga de la vacuna. Luego, saque lentamente la aguja del sitio de inyección.
- Regresa el ratón a la jaula. Repita el procedimiento con todos los animales del grupo designado.
- Apague el isoflurano y enjuague la cámara de inducción con oxígeno antes de anestesiar la siguiente jaula de ratones.
- Vigile a los animales hasta que todos estén alerta y se muevan en la jaula. Regrese la jaula a la ubicación del alojamiento.
- Monitorizar a los animales cada 12 h después de la vacunación, hasta 48 h, para detectar síntomas clínicos de morbilidad, como pelaje áspero/descuidado, marcha lenta o respiración dificultosa. Si los síntomas persisten, consulte con el veterinario de la institución y retire a los ratones del estudio si es necesario.
- Cuatro semanas después de la inmunización inicial, se administra un refuerzo a los ratones anestesiando y administrando inyecciones intramusculares en el deltoides derecho del ratón con la misma formulación de vacuna que se administró anteriormente.
- Una vez más, vigile al animal para detectar cualquier síntoma clínico. Aloje a los animales durante 2 semanas adicionales y luego proceda con la infección.
>2. Modelo de infección intranasal murina
- En el vivero, establezca las condiciones de oxígeno y anestesia como se describe en los pasos 1.3 y 1.4. Como se describe en el paso 1.5, coloque los ratones en la cámara para anestesiar. Vigile a los animales hasta que la anestesia haga efecto.
- Cuando los ratones estén anestesiados, retire un animal a la vez de la cámara de inducción. Levanta al ratón por el pescuezo del tórax dorsal, detrás de los omóplatos y el cuello. Coloque el ratón en posición vertical para acceder a la nariz.
- Con una punta de pipeta de 200 μL, aplique lentamente 40-50 μL del inóculo bacteriano de B. pertussis en las fosas del ratón (20-25 μL en cada nare). Sostenga el ratón hasta que el animal haya inhalado todo el inóculo. Si parte del inóculo burbujea, recoja las burbujas y vuelva a instilarlas en las narinas. Administre una cantidad igual de PBS estéril a un grupo de ratones como control negativo.
- Como se hizo en los pasos 1.10-1.12, regrese a los animales inoculados a su jaula y vigile a los animales hasta que estén alerta y en movimiento. Vuelva a colocar la jaula en su espacio original en el bastidor. Enjuague la cámara de inducción con oxígeno para eliminar el isoflurano residual antes de anestesiar al siguiente grupo de animales. Monitorizar a los animales durante 48 h post-infección.
- En el laboratorio, diluciones seriadas en placa del inóculo, en PBS estéril, para verificar las unidades formadoras de colonias (UFC) reales administradas a los ratones. Placa de 0,1 mL de diluciones en placas de BG + Sm al 10% (placas de agar Bordet-Gengou suplementadas con sangre de oveja desfibrinada al 10% y estreptomicina 100 μg/mL) (Figura 2A). Coloque las placas en la incubadora a 37 °C y crezca durante 4 días. Cuente y calcule las UFC a partir del inóculo entregado al ratón (Figura 2B).
>3. Recolección de tejido animal después de una infección
- Prepárese para la disección del ratón y la recolección de tejidos.
- Esterilice todas las herramientas (tijeras gruesas y finas, tijeras curvas, pinzas finas, morteros de pellets y separadores triangulares) necesarias para procesar tejidos en un autoclave. Selle las herramientas en bolsas de esterilización. Envuelva los homogeneizadores de vidrio en papel de aluminio y agregue cinta de autoclave para indicar esterilidad.
- Prepare las placas de agar 1 o 2 días antes de la recolección de tejidos para asegurarse de que las placas se solidifiquen antes de su uso. Para B. pertussis, utilice placas de etiqueta al 10% de BG + Sm. para el pulmón para cada ratón con las diluciones deseadas, determinadas empíricamente para cada experimento.
- Llene y etiquete los tubos de dilución de UFC. Añada 0,9 mL de PBS estéril a tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mL en función del número de órganos a procesar y las diluciones por órgano.
- Llene y etiquete los tubos para la recolección de tejidos:
- Pulmones: añadir 2 mL de caseína estéril al 1% en PBS a un tubo cónico estéril de 15 mL y almacenar a 4 °C. Para recolectar pulmones para la histología, agregue 2 mL de formalina tamponada neutra (NBF) al 10% y guárdelo en RT.
- El etanol fresco al 70% debe prepararse para llenar vasos de precipitados y botellas rociadoras para la disección.
- Transportar todos los materiales al vivero en un carro el día de la cosecha. Limpie el BSC y configure la máquina de anestesia como en los pasos 1.3 y 1.4.
- Colocar los ratones a diseccionar en la cámara de inducción y, con el flujo de oxígeno, encender el isoflurano al 5% y esperar hasta que los animales estén inconscientes. Retire los ratones de uno en uno y disloque cervicalmente al animal como método secundario para asegurar la muerte. Después de la luxación cervical, la eutanasia debe confirmarse por la ausencia de frecuencia respiratoria y/o la ausencia del reflejo de retirada (prueba de pellizco del dedo del pie).
- Coloque el ratón, con el lado ventral hacia arriba, sobre la tabla de disección y abra los brazos y las piernas con alfileres. Rocíe el cuerpo del ratón con etanol al 70%.
- Con unas pinzas, sujete la piel por debajo del abdomen, en el centro de la pelvis. Con unas tijeras afiladas, haz un corte vertical hasta la mandíbula. Luego, disecciona la piel lejos de la pared peritoneal separando las dos capas, usando pequeños movimientos con las tijeras cerradas. Coloque la piel a los lados del cadáver para crear un campo sin obstrucciones para la extracción estéril de órganos.
- Use pinzas para estabilizar la caja torácica en la apófisis xifoides y corte el diafragma. Los pulmones deben desinflarse y caer hacia la columna vertebral. Corta la caja torácica por los lados para quitar la coraza.
- Aislar y extirpar el lóbulo superior del pulmón derecho, cortando las arterias y venas pulmonares. Coloque el lóbulo en un tubo cónico de 15 mL que contenga un 10% de NBF y coloque el tubo en RT durante al menos 24 h para fijar el tejido. Aísle los lóbulos restantes del pulmón derecho y del pulmón izquierdo. Coloque los lóbulos en un tubo cónico de 15 mL que contenga 2 mL de caseína al 1% en PBS y colóquelo en hielo.
- Deseche el cadáver en una bolsa de riesgo biológico. Antes de diseccionar al siguiente animal, enjuague las herramientas con agua desionizada y luego colóquelas en un vaso de precipitados lleno de etanol al 70%. Retire las herramientas, sacuda el exceso de etanol y luego proceda con la siguiente disección.
- Disecciona cada ratón siguiendo los pasos mencionados anteriormente.
- Procese los tejidos como se describe a continuación.
>4. Procesamiento de los pulmones
- Transfiera los pulmones (en 2 mL de caseína al 1% en PBS) a un homogeneizador Dounce estéril de 15 mL. Utilice un mortero para homogeneizar el tejido. Disociar hasta que no queden partículas grandes de tejido. Vuelva a colocar la suspensión homogeneizada en el tubo original de 15 mL.
- Retire una alícuota de 0,3 mL para enchapar las UFC y centrifuga el homogeneizado a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Recoja y alícuota el sobrenadante en alícuotas de 0,5 mL en tubos de microcentrífuga premarcados. Almacenar las muestras a -20 °C hasta el análisis de citocinas por ELISA.
- Preparar las diluciones elegidas diluyendo en serie 0,1 mL de la suspensión pulmonar homogeneizada en tubos de dilución (0,9 mL de PBS estéril). Coloque 0,1 mL de diluciones elegidas empíricamente en placas premarcadas al 10% BG + Sm y extiéndalas con un esparcidor triangular estéril.
- Incubar las placas a 37 °C en aire ambiente durante 4 días.
- Cuente y calcule las UFC/pulmón (Figura 3). En resumen, multiplique los números de UFC recuperados por el factor de dilución de la placa, luego también por el volumen total en el que se procesó el órgano. A continuación, los cálculos de las UFC se transforman en valores de Log10 para cada animal y se grafican.
- Las placas con 30-300 colonias se cuentan de manera fácil y precisa. Las placas con menos de 6 colonias no deben usarse para cálculos ya que un número de colonias tan bajo introduce errores. Para obtener un límite inferior de detección, el volumen total en el que se homogeneizó un órgano se divide por el volumen utilizado para detectar en una placa el homogeneizado sin diluir (por ejemplo, el volumen total de 2 mL dividido por 0,1 mL de homogeneizado sin diluir es igual al límite inferior de 20 UFC detectables).
