NOTA: Los siguientes pasos se realizaron utilizando células B IIA1.6.
1. Activación de células B con perlas recubiertas de antígeno
- Preparación de perlas recubiertas de antígenos
- Para activar las células B, utilice perlas de NH2 recubiertas covalentemente con antígeno (perlas recubiertas de Ag), que se preparan utilizando 50 μL (~20 x 106 perlas) de 3 μm de perlas de NH2 con antígenos activadores (ligando BCR+) o no activadores (ligando BCR-).
- Para las células B IIA1.6, utilice el fragmento anti-IgG-F(ab')2 como ligando-BCR+ y el anti-IgM-F(ab')2 o la albúmina sérica bovina (BSA) como ligando-BCR-. Para activar las células B primarias o la línea de células B IgM+, utilice anti-IgM-F(ab')2 como BCR-ligando+ y BSA como BCR-ligando-.
nota: Para evitar la unión de los ligandos al receptor Fc, utilice fragmentos de anticuerpos F(ab') o F(ab')2 en lugar de anticuerpos de longitud completa.
- Para proceder con la preparación de perlas recubiertas de Ag, coloque las perlas en tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas para maximizar la recuperación de las perlas durante la manipulación de la muestra. Agregue 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lavar las perlas y centrifugar a 16,000 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las perlas con 500 μL de glutaraldehído al 8% para activar los grupos NH2 y gire durante 4 h a temperatura ambiente (RT).
cautela: La solución madre de glutaraldehído solo debe usarse en una campana de gases químicos. Siga las instrucciones de la hoja de datos de seguridad del material (MSDS).
- Centrifugar las perlas a 16.000 x g durante 5 min, eliminar el glutaraldehído y lavar las perlas tres veces más con 1 mL de 1x PBS.
cautela: La solución de glutaraldehído debe desecharse como residuo químico peligroso.
- Vuelva a suspender las perlas activadas en 100 μL de 1x PBS. La muestra se puede dividir en dos tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas: 50 μL para el ligando BCR+ y 50 μL para el ligando BCR.
- Para preparar la solución de antígenos, utilice dos tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 2 mL que contengan 100 μg/mL de solución de antígenos en 150 μL de PBS: un tubo con ligando BCR+ y el otro con ligando BCR.
- Agregue 50 μL de solución de perlas activadas a cada tubo que contenga 150 μL de solución de antígeno, vórtice, y gire durante la noche a 4 °C.
- Añadir 500 μL de BSA de 10 mg/mL para bloquear los grupos reactivos NH2 restantes en las perlas y girar durante 1 h a 4 °C.
- Centrifugar las perlas a 16.000 x g durante 5 min a 4 °C y eliminar el sobrenadante. Lave las cuentas con 1x PBS frío tres veces más.
- Vuelva a suspender las perlas activadas en 70 μL de 1x PBS.
- Para determinar la concentración final de perlas recubiertas de Ag, diluya un pequeño volumen de perlas en PBS (1:200) y cuente con un hemocitómetro. A continuación, conservar a 4 °C hasta su uso.
nota: Las cuentas recubiertas de Ag no deben almacenarse durante más de 1 mes.
>2. Preparación de cubreobjetos de poli-L-lisina
- Antes del ensayo de activación de células B con perlas recubiertas de Ag, prepare cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina (cubreobjetos PLL). Utilice un tubo de 50 mL que contenga 40 mL de solución de PLL al 0,01% p/v y sumerja los cubreobjetos de 12 mm de diámetro en la solución. Gire durante la noche en RT.
- Lave los cubreobjetos con 1x PBS y déjelos secar en una tapa de placa de 24 pocillos cubierta con una película de parafina. Proceda con la activación de las células B.
3. Activación de células B
- Para iniciar la activación de las células B con perlas, primero diluya la línea de células B IIA1.6 a 1.5 x 106 células/mL en medio CLICK (RPMI-1640 suplementado con 2 mM de L-alanina-L-glutamina + 55 μM de beta-mercaptoetanol + 1 mM de piruvato + 100 U/mL de penicilina + 100 μg/mL de estreptomicina) + 5% de suero fetal bovino inactivado por calor [FBS]).
- Combine 100 μL (150.000 células) de células B IIA1.6 con perlas recubiertas de Ag en una proporción de 1:1 en tubos de 0,6 mL. Mezcle suavemente con un vórtice y siembre en cubreobjetos PLL. Incubar durante diferentes puntos de tiempo en una incubadora de cultivo celular (37 °C / 5% CO2). Los puntos de tiempo de activación típicos son 0, 30, 60 y 120 min. Para el tiempo 0, coloque los cubreobjetos PLL en la tapa de la placa de 24 pocillos sobre hielo. Agregue la mezcla de perlas recubiertas de células y cocine durante 5 minutos en hielo.
nota: Es importante mezclar por vórtice en lugar de pipetear hacia arriba y hacia abajo, ya que esto podría reducir el número de perlas en la muestra, debido a su acumulación en la punta de plástico de la pipeta. Utilice perlas recubiertas con ligando BCR como control negativo para cada ensayo. Recomendamos activar primero el tiempo de incubación más largo y luego los siguientes puntos de tiempo. Calcule los intervalos de activación de las muestras de modo que estén listas para la fijación al mismo tiempo.
- Añadir 100 μL de PBS frío 1x a cada cubreobjetos para detener la activación y continuar con el protocolo de inmunofluorescencia.
