Activación de células B en un cubreobjetos recubierto de antígeno

Resumen

Fuente: Ibañez-Vega, J., et al., Estudio de la dinámica de orgánulos en células B durante la formación de sinapsis inmunes. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo muestra la activación de los linfocitos B in vitro. El proceso implica la interacción del antígeno con los receptores de las células B, lo que conduce a la remodelación del citoesqueleto, la formación de sinapsis inmunitaria, el movimiento de los lisosomas, la internalización del antígeno, el procesamiento y la posterior presentación en las moléculas MHC para la activación de las células B.

Protocolo

1. Preparación de cubreobjetos de poli-L-lisina

1. Antes del ensayo de activación de células B con perlas recubiertas de Ag, prepare cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina (cubreobjetos PLL). Utilice un tubo de 50 mL que contenga 40 mL de solución de PLL al 0,01% p/v y sumerja los cubreobjetos de 12 mm de diámetro en la solución. Gire durante la noche en RT.
2. Lave los cubreobjetos con 1xPBS y déjelos secar en una tapa de placa de 24 pocillos cubierta con una película de parafina. Proceda con la activación de las células B.

>2. Activación de células B en cubreobjetos recubiertos de antígeno

1. Preparación de cubreobjetos recubiertos de antígenos
   1. Antes de la activación, prepare la solución de antígeno (1x PBS que contiene 10 μg/mL de BCR-ligando+ y 0,5 μg/mL de rata anti-ratón CD45R/B220).
   2. NOTA: Considere preparar las hojas de cobertura el día antes del ensayo. B220 mejora la adhesión de las células B, sin embargo, el BCR-Ligand+ es suficiente para generar la respuesta de propagación.
   3. Coloque el cubreobjetos de 12 mm en una tapa de placa de 24 pocillos cubierta con una película de parafina, agregue 40 μL de solución de antígenos en cada cubreobjetos e incube a 4 °C durante la noche. Selle la placa para evitar la evaporación de la solución de antígeno.
   4. Lave los cubreobjetos con 1x PBS y séquelos al aire.
2. Activación de linfocitos B
   1. Para iniciar la activación, diluya las células B IIA1,6 a 1,5 x 10⁶ células/ml en medio CLICK + 5% FBS.
   2. Agregue 100 μL de células en un cubreobjetos recubierto de antígeno (Ag-coverslip) y actívelo para diferentes puntos de tiempo en una incubadora de células a 37 °C / 5% CO₂. Los puntos de tiempo de activación típicos son 0, 30 y 60 min.
      nota: Al igual que en la sección 1, recomendamos comenzar con el punto de tiempo de activación más largo para fijar todas las muestras al mismo tiempo.
   3. Para el tiempo 0, coloque la tapa de la placa de 24 pocillos que contiene el Ag-coverslip sobre hielo y agregue las celdas. Incubar durante 5 min en hielo.
   4. Aspire con cuidado el medio en cada cubreobjetos de Ag y luego agregue 100 μL de PBS frío 1x para detener la activación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células de linfoma B de ratón IIA1.6 (variante A20)	ATCC	TIB-208	Linfoma murino de células B de origen Balb/c que expresa un BCR que contiene IgG en su superficie sin FcγIIR
CaCl2	Guiño	CA-0520
glicina	Guiño	BM-0820
HyClone Suero fetal bovino	Thermo Fisher Scientific	SH30071.03	Inactivación del calor a 56 C durante 30 min
Kcl	Guiño	PO-1260
NaCl	Guiño	SO-1455
Parafilm	M	P1150-2
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	líquido
Poli-L-Lisina	sigma	P8920	Diluir con agua estéril
RPMI-1640	Industrias Biológicas	01-104-1A
Piruvato de sodio	Thermo Fisher Scientific	11360070
Tubo 50 ml	Corning	353043
2-mercaptoetanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
glutamina	Thermo Fisher Scientific	35050061
Anticuerpo IgG contra cabras y ratones	Jackson ImmunoResearch	315-005-003	Ligtando positivo IIA1.6