Efecto del anticuerpo anti C-fms sobre la osteoclastogénesis en células de médula ósea de ratón in vitro

Resumen

Fuente: Marahleh, A., et al. Efecto del anticuerpo anti-c-fms sobre la formación de osteoclastos y la proliferación del precursor de osteoclastos in vitro. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, demostramos el efecto de diferentes concentraciones de anticuerpos anti-c-fms en la osteoclastogénesis, que es el proceso de formación de osteoclastos a partir de progenitores de osteoclastos.

Protocolo

1. Generación de BMM

1. Siembre 1 x 10⁷ células/10 mL en una placa de cultivo de 10 cm y agregue M-CSF 100 ng/mL. La concentración final de M-CSF es de 100 ng/mL de medio de cultivo. Incubar el cultivo a 37 °C, 5% de CO₂ durante 3 días.
2. Después de 3 días, retire el medio de cultivo, lave las células enérgicamente con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces para eliminar las células no adherentes, agregue 5 mL de tripsina-EDTA al 0,02% a temperatura ambiente en PBS e incube a 37 °C, 5% CO₂ durante 5 min.
3. Separe las células mediante un pipeteo minucioso. Asegúrese de que las células se hayan desprendido observando el cultivo bajo un microscopio (las células deben aparecer redondeadas y flotando en el medio). Si las células permanecen adheridas, repita el pipeteo a fondo para separarlas. Cuando las células se hayan desprendido, agregue 5 mL de α-MEM para inactivar la reacción.
4. Recoja las células en un tubo cónico de 50 mL y centrifugue a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave con 5 mL de α-MEM.
5. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y resuspender el pellet en 10 mL de α-MEM.
6. Realice un recuento de células.
7. Siembre 1 x 10⁶ células/10 mL en una placa de cultivo de 10 cm y agregue M-CSF 100 ng/mL. La concentración final de M-CSF es de 100 ng/mL de medio de cultivo. Incubar el cultivo a 37 °C, 5% de CO₂ durante 3 días.

>2. Generación de Osteoclastos a partir de BMM como Precursores de Osteoclastos

1. Después de 3 días, recoja las células adheridas que representan BMM como precursores de osteoclastos, siguiendo los pasos 1.2-1.7.
2. Siembre BMM en 5 x 10⁴ celdas/200 μL de α-MEM en una placa de 96 pocillos. Agregue RANKL para una concentración final de 50 ng/mL o TNF-α para una concentración final de 100 ng/mL. Agregue M-CSF para obtener una concentración final de 100 ng/mL a cada pocillo.
3. Agregue el anticuerpo anti-c-fms (concentraciones finales de 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) a cada pocillo.
4. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 4 días. Cambie los medios cada dos días durante 4 días.

>3. Tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP)

1. Después de 4 días de incubación, aspire suavemente el medio de cultivo de cada pocillo. Lave cada pocillo una vez con 200 μL de temperatura ambiente 1x PBS.
2. Añadir 200 μL de formalina al 10% a cada pocillo para su fijación e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Aspirar el formol y lavar cada pocillo 3 veces con agua desionizada.
3. Añadir 200 μL de Triton X-100 al 0,2% en PBS a cada pocillo para la permeabilización e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Aspire el Triton X-100 y lave cada pocillo 3 veces con agua desionizada.
4. Agregue 200 μL de solución de tinción TRAP a cada pocillo. Visualiza la mancha bajo el microscopio. La mancha tardará entre 10 y 30 minutos en desarrollarse correctamente.
5. Aspire la mancha y lave cada pozo con agua desionizada 3 veces, y seque al aire. Manténgalo a temperatura ambiente para usarlo en observaciones posteriores.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo anti-c-Fms			AFS98, un anticuerpo c-Fms monoclonal antimurino de rata (IgG2a)
RANKL	PEPROTECH	Artículo 315-11	ligando sRANK murino recombinante, fuente: E.coli
M-CSF			M-CSF humano recombinante. 1/10 vol de sobrenadante de cultivo de línea celular CMG14-12 a 5X106 células en una placa de cultivo en suspensión de 10 cm.
α-MEM	Wako		con L-Glutamina y rojo de fenol
Suero Fetal Bovino	Biooeste	S1820-500	Suero Fetal Bovino Origen Francés
Plato de cultivo	Corning		Plato estilo 100 mm x 20 mm
Placa de 96 pocillos	Thermofisher Científico		Monja clon Delta superficie