Nanoinyección viral intratorácica para estudiar las interacciones huésped-virus en moscas adultas

Resumen

Fuente: Yang, S., et al. Establecimiento de la infección viral y análisis de la interacción huésped-virus en Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).

En este video, describimos un procedimiento para realizar una nanoinyección de un virus de ARN monocatenario de sentido positivo en moscas Drosophila macho adultas y posteriormente estudiar las respuestas antivirales iniciadas debido a la infección. El análisis de la reacción en cadena de la polimerasa identifica la regulación positiva de genes específicos en las moscas infectadas que indican la activación de vías de respuesta inmunitaria, incluida la interferencia de ARN y la señalización JAK/STAT.

Protocolo

1. Infección viral en Drosophila

1. Infectar moscas mediante nanoinyección y realizar ensayos de supervivencia.
   1. Tire de los capilares para preparar las agujas de inyección, rellene la aguja de inyección con aceite y ensamble el inyector.
   2. La anestesia vuela sobre la almohadilla bajo un ligero flujo de CO₂. Inocular moscas mediante inyección intratorácica de 50,6 nL de solución viral (100 PFU, diluido con tampón Tris-HCl, pH 7,2). Inyecte al menos 3 viales de moscas (20 moscas por vial).
      nota: La inyección requiere mucho tiempo (generalmente 100 moscas por hora....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
microscopio	Olimpo	CKX41
Inyector de nanolitros automático Nanoject II	Drummond Científico	3-000-204	Inyector automático Nanoject II de volumen variable (2,3 a 69 nL) con capilares de vidrio (110 V)
Medio para insectos de Schneider	sigma	S9895	cultivo celular
Plato de cultivo celular de 10 cm	sigma	CLS430167	cultivo celular
Incubadora Drosophila	Percival	I-41NL	Crianza de Drosophila
Filtro de 0.22um	Millipore	SLGP033RS
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	marca	352070
Tubos de microcentrífuga sin RNasa de 1,5 ml	Axygen	MCT-150-C
Sistema qPCR ABI 7500	Abi	7500	qPCR
centrífuga	Eppendorf	5810R
centrífuga	Eppendorf	5424R
cloroformo	sigma	151858	Extracción de ARN
Agua DEPC	sigma	95284-100ML	Extracción de ARN
Alcohol isopropílico	sigma	I9516	Extracción de ARN
Tampón de lisis (extracción de ARN)	Termo Fisher	15596026	Reactivo TRIzol
Tampón de lisis (extracción de ARN de muestra líquida)	Termo Fisher	10296028	Reactivo TRIzol LS
Película adhesiva óptica	Abi	4360954	qPCR
Penicilina-Estreptomicina Líquida	Invitrogen	Números 15140-122	cultivo celular
Placa qPCR	Abi	A32811	qPCR
Software estadístico	Prisma GraphPad 7
TransScript Fly Síntesis de ADNc de primera hebra SuperMix	TransScript	AT301	Extracción de ARN
vórtice	IKA	VÓRTICE 3	Extracción de ARN
FBS	Invitrogen	12657-029	cultivo celular
Placa de 96 pocillos de fondo plano	sigma	CLS3922	cultivo celular
Incubadora de células	Sanyo	MIR-553
100 tubos de repuesto	Drummond Científico	3-000-203-G/X