1. Infección viral en Drosophila
- Infectar moscas mediante nanoinyección y realizar ensayos de supervivencia.
- Tire de los capilares para preparar las agujas de inyección, rellene la aguja de inyección con aceite y ensamble el inyector.
- La anestesia vuela sobre la almohadilla bajo un ligero flujo de CO2. Inocular moscas mediante inyección intratorácica de 50,6 nL de solución viral (100 PFU, diluido con tampón Tris-HCl, pH 7,2). Inyecte al menos 3 viales de moscas (20 moscas por vial).
nota: La inyección requiere mucho tiempo (generalmente 100 moscas por hora) y la replicación del virus de Drosophila C (DCV) es muy rápida, por lo que es muy importante anotar el tiempo exacto en el tubo una vez terminado cada vial (20 moscas). La inyección de solo búfer se establece como un control ficticio. Por lo general, se prefieren las moscas adultas macho, ya que los resultados son más estables y reproducibles que cuando se usan hembras, ya que las variaciones hormonales durante el apareamiento y la reproducción pueden influir en la lectura de las hembras.
- Cultive las moscas inyectadas a 25 °C, 60% de humedad en un ciclo normal de luz/oscuridad. Suministre a las moscas alimento fresco diariamente y registre el número de moscas muertas.
- Realizar al menos 3 réplicas biológicas y trazar la curva de supervivencia.
- Para el análisis estadístico de los datos de supervivencia, genere curvas de supervivencia de Kaplan-Meier mediante software estadístico. Realice una prueba de rango logarítmico para calcular los valores P. En la tabla de supervivencia, introduzca la información de cada sujeto. A continuación, el software calcula el porcentaje de supervivencia en cada momento y traza un gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier.
nota: NO agregue levadura adicional al vial. En comparación con los controles simulados, las moscas infectadas con DCV ocasionalmente tienen ascitis y son torpes, lo que las hace vulnerables a la levadura pegajosa. Es mejor registrar más puntos de tiempo en el experimento preliminar para averiguar un marco de tiempo en el que ocurrirá la muerte masiva de las moscas infectadas. Por lo general, las moscas infectadas rara vez mueren en los dos primeros días, incluso en el caso de las líneas mutantes Dicer-2. En el caso de la mosca w1118 (Bloomington 5905) libre de Wolbachia infectada con 100 PFU de DCV, esta ventana de tiempo es de alrededor de 3 a 5 días después de la infección. Las moscas de la fruta que mueren dentro de las 0.5 horas posteriores a la inyección no deben contarse como una muerte porque pueden morir por lesión con aguja, no por infección viral.
>2. Medición de la carga de DCV mediante ensayo de efecto citopático (CPE)
- El día 1, infecte a las moscas macho como se describe en los pasos 1.1.1-1.1.2. Agrupe las moscas inyectadas en grupos de 20 y manténgalas creciendo con alimento fresco para moscas durante el tiempo deseado (generalmente durante 24 h o 3 días). Proporcione a las moscas alimentos frescos todos los días.
- El día 2, siembre células de Drosophila S2* en una placa de cultivo celular de 10 cm a una densidad de aproximadamente 5 x106 a 1x107 células/mL.
- El día 3, recoja 5 moscas (bajo un ligero flujo de CO2) y muélalas en un tubo de centrífuga de 1,5 mL durante 30 s con 200 μL de tampón Tris y perlas de cerámica utilizando un homogeneizador. Guarde las muestras a -80 °C o continúe inmediatamente con el siguiente paso.
- Vórtice completamente la muestra. Utilice una jeringa de 1 mL y un filtro de 0,22 μm para filtrar el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mL.
- Realizar diluciones en serie de 10 veces el sobrenadante con medio completo para células S2*. Agregue diluciones de 50 μL en el pocillo. Añadir 50 μL de medio de cultivo sin virus al pocillo clasificado como pocillo testigo negativo.
nota: Para cada tasa de dilución se utilizaron 8 pocillos. Como el rendimiento típico de DCV es de alrededor de 108-10 9 PFU / mL, la dilución debe cubrir al menos ~ 10-5-10-10.
- El día 4, observe la EPC con un microscopio de campo claro con un objetivo de 20X o 40X. Clasifique un pocillo en el que las células se ven borrosas y el medio está lleno de fragmentos como un "pozo positivo", y un pocillo en el que la morfología celular es normal como un "pozo negativo".
- Marque los pozos positivos o negativos de CPE con + o –, respectivamente. Calcular la dosis infectiva media de cultivo de tejidos virales (TCID50).
>3. Carga de DCV medida por qRT-PCR
- El día 1, infecta a las moscas como se describió anteriormente. Inyectar moscas macho en grupo (20 moscas/grupo) y cultivarlas con alimento fresco para moscas durante el tiempo deseado, normalmente durante 24 h o 3 días. Proporcione a las moscas alimentos frescos todos los días.
- El día 3, recoja 5 moscas bajo un ligero flujo de CO2 en un tubo de 1,5 mL con 200 μL de tampón de lisis y 20 perlas cerámicas (diámetro = 0,5 mm), y triture las muestras con un homogeneizador a alta velocidad durante 30 s. Añada 800 μL de tampón de lisis adicional a cada tubo y almacene las muestras a -80 °C o realice inmediatamente la extracción de ARN y qRT-PCR.
- Prepare puntas, tubos y agua desionizada, tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) y filtrada por membrana de 0,22 μm. Añadir 200 μL de cloroformo (≥99,5%) a la muestra y agitar enérgicamente durante 15 s con la mano. Incubar durante 5 minutos o más a temperatura ambiente hasta que la fase acuosa y la fase orgánica estén claramente separadas.
nota: El cloroformo es extremadamente peligroso y debe manipularse con cuidado. NO haga vórtices en la muestra, lo que aumentará el riesgo de contaminación del ADN.
- Centrifugar muestras a 13.000 x g durante 15 min a 4 °C.
- Recoja 400 μL de sobrenadante y transfiera el sobrenadante a nuevos tubos. Mezclar con el mismo volumen de isopropanol (≥ 99,5%), invertir suavemente las muestras 20 veces a mano y luego precipitar durante 10 min o más a temperatura ambiente><.
nota: La precipitación a -20 °C aumentará el rendimiento de ARN.
- Centrifugar muestras a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C. Los gránulos de ARN blanco son visibles en la parte inferior del tubo.
- Deseche el sobrenadante y agregue 1 mL de etanol al 70% (etanol en agua DPC) e invierta varias veces para lavar el ARN.
- Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y el ARN seco durante 5-10 min; El ARN debe volverse transparente.
- Añada 50 μL de agua DEPC a la muestra, pipetee varias veces y vórtice.
- Tome 3 μL de ARN para ajustar la concentración de ARN. Cuantificar el ARN a 260 nm. Normalmente, la concentración de ARN extraído por este protocolo es de aproximadamente 100-500 μg/μL, que es adecuada para la síntesis de ADNc.
- Utilice 2 μg de ARN para la síntesis de ADNc. Diluir la muestra a 100 μL con ddH2O y almacenar a -20 °C.
- Realice qRT-PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante y ejecute qRT-PCR.
nota: Para la síntesis de ADNc de DCV, los cebadores aleatorios funcionaron mucho mejor que los cebadores Poly A. La expresión del ARNm de DCV se normaliza a ARNm de la proteína ribosómica endógena 49 (rp49). Cebadores de oligonucleótidos utilizados en esta parte:
rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (delantero) y
5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (reverso);
DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (proa) y
5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (reverso);
vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (delantero) y
5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (reverso);
ARN 1 (vir-1) inducido por virus 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (adelante) y
5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (reverso).
