Method Article

Visualización de la activación de caspasas en macrófagos derivados de monocitos humanos

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fuente: Bolívar, B. E., et. al., Visualización de la proximidad inducida por caspasas inflamatorias en macrófagos derivados de monocitos humanos. J. Vis. Exp. (2022).

Este video demuestra la activación de proteínas caspasas en macrófagos humanos utilizando proteínas reporteras de complementación de fluorescencia bimolecular. Los prodominios de la caspasa-1 se fusionan con fragmentos no fluorescentes de las proteínas de Venus, que se reclutan para los complejos de inflamasoma. La proximidad de los inflamasomas induce el repliegue y la fluorescencia de los fragmentos de Venus, lo que confirma la activación de las caspasas en los macrófagos.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

>1. Aislamiento de monocitos humanos y diferenciación en macrófagos

  1. Obtener sangre anticoagulada de individuos sanos no identificados en un banco de sangre regional y aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como se indica a continuación><. nota: Realice todos los pasos en una campana de flujo laminar para cultivo de tejidos. Use solo t....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Figura 1: Resumen esquemático del flujo de trabajo experimental.

figure-results-2
Figura 2: Diferenciación de monocitos CD14 y transfección de MDM humano. (A) Imágenes representativas de campo claro de monocitos CD14+ de sangre peri.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cultivo de tejidos de 48 pocillos2:34 placasGenesee Científico25-108
Placas de cultivo de tejidos de 10 cmVWR25382-166
2 Mercaptoetanol 1000xThermo Fisher Scientific21985023
Cubreobjetos de 8 pocillos con cubreobjetos de 1,5 CVCellvisc8-1.5H-N
Columnas de AutoMACSMiltenyi (Biotec)130-021-101Solo para la separación automatizada con el separador AutoMACS Pro
Separador AutoMACS ProMiltenyi (Biotec)Teléfono 130-092-545Solo para la separación automatizada con el separador AutoMACS Pro
Solución de lavado AutoMACS ProMiltenyi (Biotec)130-092-987Solo para la separación automatizada con el separador AutoMACS Pro
Solución de enjuague AutoMACSMiltenyi (Biotec)130-091-222Solo para la separación automatizada con el separador AutoMACS Pro
Búfer de ejecución de AutoMacsMiltenyi (Biotec)130-091-221Para la separación manual o automatizada con QuadroMACS o AutoMACS pro Separator
Microscopio invertido motorizado Axio Observer Z1 equipado con una unidad de disco giratorio CSU-X1A 5000ZeissSe puede utilizar cualquier microscopio confocal equipado con un módulo láser equipado con líneas láser de longitudes de onda de 568 nm (RFP) y 488 o 512 nm (GFP o YFP)
AxioObserver A1, microscopio invertido de grado de investigaciónZeissSe puede utilizar cualquier microscopio de epifluorescencia con filtros de fluorescencia capaces de excitar longitudes de onda de 568 nm (RFP) y 488 o 512 nm (GFP o YFP)
MICROPERLAS CD14+Miltenyi (Biotec)130-050-201Para la separación manual o automatizada con QuadroMACS o AutoMACS pro Separator
DPBS sin cloruro de calcio y cloruro de magnesiosigmaD8537-6x500ML
Plásmido DsRed mitoClontech632421Plásmidos similares que se pueden usar como reporteros fluorescentes se pueden encontrar en Addgene
Suero Fetal BovinoThermo Fisher Scientific10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mLsigmaGE17-1440-02
Suplemento GlutaMAX (100x)Thermo Fisher Scientific35050079
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC2011
Hemin BioXtra, de Porcino, INSERTO CHARACTR96.0% (HPLC)sigma51280-1G
HEPESThermo Fisher Scientific15630106
Caspasa inflamatoria Pásmidos BiFCDisponible a petición del laboratorio LBH
LPS-EB UltrapuroInvivogenTLRL-3PELPS
Columnas LSMiltenyi (Biotec)130-042-401Solo para la separación manual con el separador QuadroMACS
Gradilla de tubos MACS de 15 mlMiltenyi (Biotec)130-091-052Solo para la separación manual con el separador QuadroMACS
MACS MultiStandMiltenyi (Biotec)130-042-303Solo para la separación manual con el separador QuadroMACS
plásmido mCherryLaboratorio de Yungpeng WangPlásmidos similares que se pueden usar como reporteros fluorescentes se pueden encontrar en Addgene
Sistema de transfección de neónThermo Fisher ScientificMPK5000Incluye dispositivo de electroporación de neón, pipeta y estación de pipetas
Kit de sistema de transfección de neón de 10 μLThermo Fisher ScientificMPK1096Incluye tampón de resuspensión R, tampón de resuspensión T, tampón electrolítico E, 96 x 10 μL Puntas de neón y tubos de electroporación de neón
Sal sódica de nigericina, solución preparadasigmaSML1779-1ML
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Hidrobromuro de poli-D-lisinasigmaP7280-5mg
Separador QuadroMACSMiltenyi (Biotec)130-090-976Solo para la separación manual con el separador QuadroMACS
qVD-OPhPescador (ApexBio)50-101-3172
RPMI 1640 MedioThermo Fisher Scientific11875119
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenolThermo Fisher Scientific25200072
Ultrapuro 0,5 m EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575020

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caspase ActivationHuman MacrophagesBimolecular Fluorescence ComplementationInflammasome ComplexEpifluorescence MicroscopyLipopolysaccharide TreatmentNigericin StimulusVenus Protein ReporterCaspase 1 Pro domainTransfection Protocol

Related Articles