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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
>1. Aislamiento de monocitos humanos y diferenciación en macrófagos
- Obtener sangre anticoagulada de individuos sanos no identificados en un banco de sangre regional y aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como se indica a continuación><.
nota: Realice todos los pasos en una campana de flujo laminar para cultivo de tejidos. Use solo tubos estériles y guantes de uso. Agregue un 10% de lejía a todos los productos relacionados con la sangre cuando los deseche. La solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) (1x) o la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) (sin Ca2+ y Mg2+) se pueden utilizar indistintamente.
- Prepare el tampón de dilución: Complemente 1x PBS estéril con un 2% de suero fetal bovino (FBS) y 0,5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
- Prepare el medio de cultivo: Complemente el medio RPMI-1640 con FBS (10% (v/v)), glutamax (2 mM) y penicilina/estreptomicina (50 U.I./50 μg/mL)
- Enfriar previamente el tampón de funcionamiento (Tabla de Materiales) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Diluya la sangre entera con dos volúmenes de tampón de dilución. Con una pipeta serológica, transfiera 15 mL de la sangre anticoagulada a un tubo de 50 mL que contenga 30 mL del tampón de dilución. Mezclar suavemente por inversión.
- Por cada 10 mL de sangre entera o 30 mL de sangre diluida, agregue 15 mL del medio de gradiente de densidad a un tubo vacío de 50 mL.
- Cubrir el medio de gradiente de densidad del paso 1.1.5 con 30 mL de sangre diluida lenta y constantemente utilizando una pipeta serológica de 25 mL. Mantenga la punta de la pipeta contra la pared del tubo y el tubo en un ángulo inclinado.
- Transfiera con cuidado los tubos a una centrífuga de cubo oscilante. Evite perturbar las dos fases. Centrifugar los tubos a 400 x g a temperatura ambiente (RT) durante 25 min con la aceleración y la deceleración ajustadas al valor mínimo.
- Retire con cuidado la capa superior de plasma (transparente) con una pipeta de 10 ml y deséchela en un recipiente con lejía (10%).
- Recoja la capa de interfase (blanca) de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, Figura 1) con una pipeta de 10 mL y transfiérala a un tubo nuevo de 50 mL. Combine la capa blanca de diferentes tubos del mismo donante en un tubo de 50 mL hasta 30 mL.
- Llevar cada tubo a un volumen total de 50 mL con el tampón de dilución del paso 1.1.1 y centrifugar a 300 x g y 4 °C durante 10 min. Retirar el sobrenadante con una pipeta de 10 mL y desecharlo en un recipiente con lejía (10%).
- Vuelva a suspender cada gránulo de celda en 1 ml del tampón de funcionamiento preenfriado del paso 1.1.3 utilizando una micropipeta p1000. Combine las suspensiones celulares del mismo donante en un nuevo tubo de 15 mL. Lleve el volumen de cada tubo a 15 mL con un tampón de funcionamiento preenfriado y mezcle bien por inversión.
- Tome una alícuota de 20 μL de la suspensión celular del paso 1.1.11 y prepare una dilución 1:100 utilizando PBS estéril 1x. Determine el número de células con un hemocitómetro.
- Centrifugar la suspensión celular del paso 1.1.11 a 300 x g y 4 °C durante 10 min y eliminar el sobrenadante con una pipeta de 10 mL. Si es necesario, utilice una micropipeta p200 para eliminar completamente el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las PBMC aisladas en 80 μL de tampón de funcionamiento MACS preenfriado para cada celda 1 x 107, sumando un máximo de 800 μL del tampón.
- Agregue 20 μL de MicroBeads CD14 antihumanos por cada 1 x 107 células o hasta 100 μL por muestra de sangre (~100 mL de sangre sin diluir). Mezclar bien por inversión y colocar en un rotador de tubo durante 20 min con mezcla continua a 4 °C.
- Retire las muestras del rotador de tubos, añada 10 mL de tampón de funcionamiento preenfriado a cada tubo y centrifugue a 300 x g (aceleración = 5, deceleración = 5) y 4 °C durante 10 min.
- Retire el sobrenadante con una pipeta de 10 ml y vuelva a suspender hasta 1 x 108 células en 500 μl de tampón de funcionamiento preenfriado (2 x 108/ml).
- Realice el aislamiento de las células CD14 positivas mediante clasificación magnética de células utilizando un sistema manual o automatizado (Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante.
- Tome una alícuota de 20 μL de la suspensión celular del paso 1.1.18 después de la selección positiva para CD14 y prepare una dilución 1:100 con PBS estéril 1x. Determine el número de células contando las células en un hemocitómetro.
- Centrifugar las células CD14 positivas a 300 x g y RT durante 10 min. Eliminar el sobrenadante con una pipeta de 10 mL o un sistema de vacío.
- Vuelva a suspender el pellet de células del paso 1.1.20 en un medio de cultivo precalentado del paso 1.1.2 hasta una densidad celular final de 1 x 107 células/mL.
- Siembre los monocitos CD14 positivos aislados con una densidad celular de 5 x 106 células.
- En una placa de cultivo de tejidos de 10 cm, añadir 10 mL de medio de cultivo del paso 1.1.2 suplementado con 50 ng/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).
- Añada 0,5 mL de la suspensión celular del paso 1.1.21 al medio de cultivo gota a gota y agite suavemente la placa. Incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada (37 °C, 5% CO2) durante la noche.
- Al día siguiente, aspire el medio usando un sistema de vacío para eliminar las células que no se adhirieron durante la noche. Añadir 10 mL de medio de cultivo fresco suplementado con GM-CSF (50 ng/mL) e incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada (37 °C, 5% CO2) durante 7 días para permitir una diferenciación completa (ver Figura 2A para la aparición de monocitos CD14+ en varias etapas de diferenciación en GM-CSF). Cambie el medio de cultivo cada 2-3 días y complemente con GM-CSF fresco (50 ng/mL) cada vez.
>2. Preparación de los componentes de la electroporación
NOTA: Este protocolo está diseñado para una punta de neón de 10 μL (Tabla de materiales). Para cada transfección, use 1-2 x 105 celdas. Se recomienda sembrar las células transfectadas en una placa de 48 pocillos o en una placa de 8 pocillos (10 μL de células transfectadas por pocillo). Se puede utilizar 1x DPBS estéril (sin Ca2+ y Mg2+) en lugar de PBS.
- El día 7, prepare un medio libre de antibióticos complementando el medio RPMI-1640 con FBS (10 % (v/v)) y glutamax (2 mM).
- Coloque el medio RPMI-1640 sin suero, la solución de tripsina-EDTA (0,25%), 1x PBS estéril (sin Ca2+ y Mg2+) y el medio de cultivo completo del paso 1.1.2 en un baño de agua a 37 °C.
- Si utiliza placas con fondo de vidrio (para microscopía confocal), cubra las placas con bromuro de poli-D-lisina.
- Cubrir una placa de 8 pozos con 200 μL de hidrobromuro de poli-D-lisina (0,1 mg/mL en PBS estéril 1x) e incubar durante 5 min a RT.
- Aspire la solución de poli-D-lisina y lave el vidrio una vez con 1x PBS estéril. Aspire el PBS y continúe con el paso 2.4.
- Añadir 200 μL de medio libre de antibióticos por pocillo de la placa de 48 pocillos o de la placa de 8 pocillos y preincubar en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada (37 °C, 5% CO2) hasta que esté listo para colocar las células transfectadas.
>3. Preparación de celdas para electroporación
NOTA: El rendimiento de MDM de una placa de 10 cm al final del período de diferenciación de 7 días es de aproximadamente 1,5 x 106 células. Se puede utilizar 1x DPBS estéril (sin Ca2+ y Mg2+) en lugar de PBS. Este protocolo se optimizó para que la mayoría de los macrófagos se separen de la placa con el mantenimiento de la viabilidad e integridad celular. El MDM es difícil de separar de las placas de cultivo celular. Por lo tanto, puede ser necesario realizar los pasos 3.2 y 3.3 dos veces para disociar las células. Asegúrese de que cada tiempo de incubación con tripsina-EDTA (0,25%) no supere los 5 min.
- Aspire los medios de macrófagos completamente diferenciados en platos de 10 cm y lave la monocapa celular con medio RPMI-1640 tibio sin suero. Asegúrese de eliminar completamente el medio.
- Recolectar las células añadiendo 2 mL de solución tibia de tripsina-EDTA (0,25%) por plato de 10 cm e incubar en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada (37 °C, 5% CO2) durante 5 min.
- Complete el desprendimiento de la célula pipeteando suavemente la solución de tripsina-EDTA (0,25%) hacia arriba y hacia abajo por toda la zona de la placa con una micropipeta p1000. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de medio de cultivo completo tibio del paso 1.1.2.
- Lleve la placa a un microscopio de campo brillante y verifique si hay desprendimiento de células en varios campos de visión. Si todavía hay una cantidad considerable de celdas conectadas, repita los pasos 3.2-3.3.
- Centrifugar la suspensión de la célula a 250 x g durante 5 min en RT.
- Aspirar el medio y resuspender las células en 10 mL de 1x PBS estéril precalentado a 37 °C. Tome una alícuota de 20 μL para determinar el número de células usando un hemocitómetro.
- Tome 1-2 x 105 células por transfección prevista y colóquelas en un tubo de 15 ml. Llevar a un volumen final de 15 mL con PBS estéril precalentado 1x. Centrífuga a 250 x g durante 5 min a RT.
- Aspire el PBS y centrifugue una vez más durante 1 minuto a 250 x g. Elimine cualquier residuo de PBS del pellet de la celda con una micropipeta p200.
>4. Nucleofección de componentes de caspasa BiFC en macrófagos derivados de monocitos humanos
NOTA: Esta sección del protocolo se realiza utilizando el Sistema de Transfección de Neón (Tabla de Materiales). Este protocolo describe los pasos para transfectar 1-2 x 105 celdas usando una punta de neón de 10 μL (Tabla de materiales). Si utiliza una punta de neón de 100 μL, amplíe en consecuencia. Evite exponer las células al tampón de resuspensión R durante más de 15 minutos, ya que esto puede disminuir la viabilidad celular y la eficiencia de la transfección.
- Diluya el plásmido reportero (es decir, mCherry o dsRedmito a 100 ng/μL) en agua libre de nucleasas o tampón TE 0,5x para visualizar las células transfectadas.
- Diluir los plásmidos de caspasa BiFC a una concentración adecuada en agua libre de nucleasas o en tampón TE 0,5x, de modo que el volumen total de plásmidos no supere el 30% del volumen total de transfección de 10 μL (es decir, 300 ng/μL de C1 Pro-VC y 300 ng/μL de C1 Pro-VN).
- Prepare un microtubo estéril de 1,5 mL por transfección prevista y agregue la cantidad adecuada de plásmido indicador (es decir, 50 ng o 0,5 μL) y plásmidos de caspasa BiFC (es decir, 300 ng o 1 μL de C1 Pro-VC y 300 ng o 1 μL de fragmento C1 Pro-VN). Mantenga los microtubos en el capó en todo momento.
- Coloque la estación de pipeta, el dispositivo, las puntas, los tubos de electroporación y la pipeta en una campana de flujo laminar estéril.
nota: La estación de pipeta, el dispositivo, las puntas, los tubos de electroporación y la pipeta están incluidos en el sistema de transfección de neón.
- Conecte el conector de alto voltaje y sensor de la estación de pipetas a los puertos traseros del dispositivo según las instrucciones del fabricante. Mantenga la estación de pipetas cerca del dispositivo.
- Conecte el cable de alimentación a la entrada de CA trasera y proceda a conectar el dispositivo a la toma de corriente. Presione el interruptor de encendido para encender el dispositivo.
- Introduzca los parámetros de transfección en la pantalla de inicio que se muestra cuando el dispositivo está encendido y conectado correctamente. Presione Voltaje, ingrese 1000 y presione Done para configurar el voltaje a 1000 V. Presione Ancho, ingrese 40 y presione Listo para establecer la duración del pulso en 40 ms. Por último, presione # Pulsos, ingrese 2 y presione Listo para establecer el número de pulsos eléctricos en 2.
- Tome uno de los tubos de electroporación (suministrados en el kit) y llénelo con 3 mL de tampón electrolítico E (para puntas de 10 μL y suministrado en el kit) en RT. Inserte el tubo de electroporación en el soporte de pipetas de la estación de pipetas. Asegúrese de que el electrodo en el costado del tubo esté hacia adentro y que se escuche un sonido de clic cuando se inserte el tubo.
- Tome el pellet de celda del paso 3.8 y agregue 10 μL de tampón R de resuspensión precalentado (proporcionado en el kit) por cada 1-2 x 105 celdas. Mezclar suavemente con una micropipeta p20. Añada 10 μL de la suspensión celular a cada tubo configurado en el paso 4.3 y mezcle suavemente con una micropipeta p20.
- Tome la pipeta e inserte una punta presionando el botón Push en el segundo tope. Asegúrese de que la abrazadera recoja completamente el vástago de montaje del pistón en la punta y de que no se observe ningún espacio en la cabeza superior de la pipeta.
- Para aspirar la muestra, pulse el botón pulsador de la pipeta hasta el primer tope y sumérjala en el primer tubo que contiene la mezcla de ADN célula/plásmido. Aspire lentamente la mezcla en la punta de la pipeta.
nota: Evite las burbujas de aire, ya que pueden causar arcos eléctricos durante la electroporación y, si el dispositivo las detecta, pueden impedir la entrega del pulso eléctrico. Si se observan burbujas de aire, libere el contenido en el tubo e intente aspirar de nuevo.
- Inserte la pipeta con la muestra con mucho cuidado en el soporte de la pipeta. Asegúrese de que la pipeta haga clic y de que esté colocada correctamente.
- Presione Inicio en la pantalla táctil y espere hasta que se entreguen los impulsos eléctricos. Un mensaje en la pantalla indicará que se ha completado.
- Retire lentamente la pipeta de la estación e inmediatamente agregue la suspensión celular transfectada en el pocillo correspondiente con medio libre de antibióticos precalentado desde el paso 2.4 presionando lentamente el botón hasta la primera parada.
nota: Esta punta se puede reutilizar hasta tres veces para el mismo plásmido; de lo contrario, deséchelo en un contenedor de desechos de riesgo biológico presionando el botón Push hasta la segunda parada.
- Repita los pasos 4.10-4.14 para cada tubo que contenga una mezcla de ADN celular/plásmido.
- Meca suavemente la placa con células transfectadas e incube durante 1-3 h en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada (37 °C, 5% CO2).
- Añadir a cada pocillo 200 μL de medio de cultivo precalentado (medio completo) a partir del paso 1.1.2. Vuelva a colocar la placa en la incubadora de cultivo de tejidos humidificada (37 °C, 5% CO2). Espere al menos 24 horas para la expresión génica.
- Al día siguiente, inspeccione la viabilidad celular y la eficiencia de la transfección utilizando un microscopio de epifluorescencia.
- Encienda el microscopio de epifluorescencia y la caja de la fuente de luz fluorescente según las instrucciones del fabricante y coloque la placa de cultivo en la platina del microscopio.
- Seleccione el objetivo 10x o 20x y el filtro de 568 nm (RFP).
- Para estimar la viabilidad de la celda, presione el botón LED de luz transmitida (TL) para visualizar todas las celdas en el campo seleccionado. Mientras mira en el ocular del microscopio, gire la perilla de enfoque hasta que se observen las células y verifique la unión de las células en el campo seleccionado.
nota: Las células totalmente adheridas representan las células viables, mientras que las células flotantes representan las células no viables. Si la confluencia del pozo es alta, la presencia de células no adheridas podría ser el resultado de una sobreestimación del número de células y no el resultado de una baja viabilidad. Sin embargo, la baja confluencia acompañada de un alto contenido de células flotantes significa una baja viabilidad que puede resultar de la formación de arcos durante la electroporación, la toxicidad del plásmido o la sobreexposición al tampón R de resuspensión. No utilice pozos que muestren este último comportamiento.
- Para estimar la eficiencia de la transfección, concéntrese en las celdas del campo seleccionado bajo luz transmitida como se describió anteriormente. Cuente el número total de celdas en el campo seleccionado. Con el LED de luz transmitida (TL) apagado, presione el botón LED de luz reflejada (RL) para encenderlo.
- Concéntrese en la fluorescencia del gen reportero (glóbulos rojos) y cuente el número total de glóbulos rojos fluorescentes. Repita estos pasos (4.18.4-4.18.5) para al menos dos campos más por pozo.
>5. Tratamiento de la adquisición de datos de MDM transfectada y caspasa BiFC
NOTA: Si planea obtener imágenes de las células utilizando un microscopio de epifluorescencia o confocal, se recomienda el tratamiento con qVD-OPh (20 μM) durante 1 h antes del tratamiento con el estímulo elegido para prevenir la muerte celular dependiente de caspasas (predominantemente apoptosis). Esto se utiliza en la obtención de imágenes para evitar que las células se despeguen debido a la apoptosis, lo que hace que sea muy difícil obtener imágenes a medida que se mueven fuera del plano focal. Obsérvese que el reclutamiento de caspasas a la plataforma de activación y al BiFC de caspasas asociado no depende de la actividad catalítica de la caspasa y, en consecuencia, la inhibición de la caspasa no afectará a este paso.
- Tratar con el estímulo elegido aproximadamente 24 h después de la transfección e incubar durante el tiempo que sea necesario para cada fármaco.
- Prepare el medio de imagen complementando el medio de cultivo del paso 1.1.2 con Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) y 2-mercaptoetanol (55 μM).
- Agregue la concentración deseada de estímulo al medio de imagen precalentado y mezcle suavemente.
- Retire los medios de las celdas con cuidado con una micropipeta p1000 y agregue 500 μL de la solución estimulante del paso 5.1.2 por el costado del pocillo.
- Para hacer funcionar pozos de control no tratados, agregue un medio de imagen sin el estímulo.
- Incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada (37 °C, 5% CO2) durante el tiempo que se indique para cada tratamiento.
- Visualice las células utilizando un microscopio de epifluorescencia o confocal.
- Encienda el microscopio y la fuente de luz fluorescente, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Seleccione el objetivo 10x o 20x y coloque la placa de cultivo en la platina del microscopio.
- Con el ocular del microscopio, encuentre las células bajo el filtro de 568 nm y concéntrese en las células que expresan el indicador dsRedmito/mCherry (glóbulos rojos).
- Cuente todos los glóbulos rojos en el campo visual y anote el número.
- Mientras está en el mismo campo visual, cambie a los filtros 488 o 512 (GFP o YFP), proceda a contar el número de glóbulos rojos que también son verdes (Venus positivo o BiFC positivo), y registre el número.
- Cuente al menos 100 células dsRedmito/mCherry positivas de un mínimo de tres campos visuales individuales.
