Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación del experimento
- Fabricación del dispositivo de cultivo de órganos intestinales (3 días)
- Usando una impresora 3D, imprima los moldes de plástico reutilizables para el dispositivo de cultivo de órganos (el dispositivo tiene 6 pocillos, con 24 orificios pequeños y grandes, y para la tapa de la tapa del dispositivo).
NOTA: Estos moldes de plástico se pueden utilizar para la fabricación de numerosos dispositivos.
- Inserte las agujas de extremo romo (22 G y 18 G) en la posición adecuada dentro del molde del dispositivo y mezcle aproximadamente 20 g de mezcla de polidimetilsiloxano (PDMS) (relación de peso 1:10, base a catalizador) para un juego del dispositivo y la tapa.
- Coloque los moldes en una cámara de vacío durante 30 minutos, para eliminar las burbujas de aire de la mezcla de PDMS.
- Incubar los moldes a 55 °C durante la noche, para completar la polimerización de PDMS.
- Cuando el PDMS esté configurado, saque las agujas del molde y suelte con cuidado el dispositivo de cultivo y la tapa de los moldes de plástico.
- Elimine los residuos de PDMS del contorno del pocillo con una cuchilla quirúrgica. Fije el dispositivo PDMS y la cubierta del dispositivo sobre un cubreobjetos (microportaobjetos de 75 mm x 50 mm) con adhesivo de silicona no tóxico y deje que las piezas se asienten durante la noche (aplique el pegamento en el lado liso del dispositivo).
- Inserte doce agujas de 22 G para el lumen y doce agujas de 18 G para el pocillo. Fije todas las agujas en su lugar con silicona y deje que se asiente durante la noche. Inserte dos agujas de 18 G en la tapa de la cubierta para que el flujo de aire adecuado entre y salga del dispositivo de cultivo de órganos intestinales.
- Revise todas las agujas en busca de fugas con una jeringa llena de agua. Verifique que no haya fugas de los pozos llenándolos con agua.
- Coloque dos nudos quirúrgicos en cada aguja de 22 G que se conectará al colon. Coloque el dispositivo y la tapa en una bolsa de papel de autoclave y esterilícelo en un autoclave.
- Medio de cultivo (0,5 h)
- En una campana biológica, mezcle lo siguiente (en un tubo de 50 mL): 37 mL de Medio de Dulbecco Modificado (IMDM) de Iscove, 10 mL de reemplazo de suero KSR, 1 mL de suplemento de B27, 0,5 mL de suplemento N2, 0,5 mL de tampón HEPES 1 M y 0,5 mL de aminoácidos no esenciales.
- Filtre y almacene el medio completo a 4 °C.
- Preparación de tubos y herramientas quirúrgicas
- Corte la longitud adecuada de los tubos para el lúmene de entrada, el pozo de entrada, el lúmene de salida y el pozo de salida (12 tubos cortos y 12 tubos largos). Conecte un adaptador adecuado a cada lado del tubo.
- Prepare las herramientas quirúrgicas: tijeras rectas, 4 pinzas finas y 2 pinzas afiladas.
- Coloque los tubos y las herramientas quirúrgicas en una bolsa de papel de autoclave y esterilícelos con un autoclave.
- Prepare la entrada luminal (estimulación deseada: bacterias, heces, medicamentos, etc.).
- Antes del experimento, determinar la carga bacteriana del cultivo bacteriano, mediante diluciones seriadas, y cultivo en condiciones aeróbicas y/o anaeróbicas.
- Después de calcular la carga bacteriana, diluya los cultivos bacterianos en un medio de cultivo de tejido estéril para obtener la concentración bacteriana requerida. En el caso de las muestras fecales, filtrar con un colador de 100 μm.
nota: Para la estimulación no bacteriana (fármacos, metabolitos, etc.), diluir la sustancia hasta la concentración requerida utilizando el medio de cultivo intestinal.
>2. Preparación de la configuración del experimento
- Dentro de la incubadora de cultivos de órganos, encienda la unidad calefactora y ajústela a 37 °C.
- Configure las bombas, así como las jeringas de entrada y salida.
- Entrada de medio de cultivo de tejidos
- En una campana de flujo biológico o laminar, llene las jeringas del pocillo de entrada con un medio de cultivo completo. El volumen final depende de la duración del experimento y del caudal; generalmente 1 mL/h más un medio adicional para la purga.
- Conecte los tubos a las jeringas con el adaptador Luer-lock. Coloque las jeringas llenas en las bombas de jeringa.
- Purgue las jeringas de entrada. Asegúrese de que el medio del pozo fluya desde todos los tubos hacia un vaso de desecho.
- Entrada luminal
- Llene las jeringas de entrada luminal con tratamiento de estimulación (bacterias, fármacos, etc.). El volumen depende de la duración del experimento y del caudal (normalmente 30 μL/h más un medio adicional para la purga).
- Conecte los tubos a las jeringas con el adaptador Luer-lock. Coloque las jeringas llenas en las bombas de jeringa.
- Purgue las jeringas de entrada. Asegúrese de que la estimulación fluya fuera de todos los tubos hacia un vaso de desecho. Tenga cuidado de no contaminar las diferentes estimulaciones.
- Salidas
- Coloque las jeringas vacías en las bombas de jeringa de salida (ajuste el modo de bomba a 'extracción').
- Configuración del dispositivo
- Ajuste el regulador que controla el caudal de la mezcla de gases (95% O2 + 5% CO2) para un caudal suave y mínimo.
- Examine el dispositivo en una capucha laminar.
- Enjuague las agujas del dispositivo con IMDM estéril para lavar las agujas.
- Añada 500 μL de medio de cultivo estéril en cada pocillo del dispositivo.
- Preparación para la disección de tejidos
- Coloque los instrumentos quirúrgicos estériles dentro de la capucha laminar.
- Llene una jeringa de 10 ml con IMDM estéril y conecte una aguja estéril (esterilizada en autoclave) de 22 g para lavar el colon.
>3. Cultivos de órganos
- Sacrificio de ratones y disección de tejidos
- En una capucha laminar, sacrifique ratones de 12 a 14 días de edad por decapitación. Rocíe los ratones con etanol al 70% y colóquelos en un plato de plástico.
- Con tijeras afiladas y pinzas, diseccione el ratón y extraiga el tracto digestivo desde el estómago hasta el ano cortando toda la grasa y los tejidos conectivos. Corta el colon y colócalo en un plato nuevo.
nota: Minimice el contacto con el tejido del colon. No toque la parte media del tejido del colon. Sostenga el pañuelo suavemente y solo en los bordes del pañuelo.
- Lavado y lavado de colon
- Bajo un microscopio de disección, enjuague suavemente el contenido del colon con IMDM estéril (en el lado proximal) con la jeringa de 10 ml preparada (paso 2.7.2). Después de eliminar las heces del tejido intestinal, coloque el colon en una nueva placa de 6 pocillos llena de 0,5 ml de IMDM estéril.
- Conexión de los dos puntos al dispositivo
- Tome el pañuelo, conéctelo con cuidado a la aguja de 22 G y haga un lazo apretado con los dos hilos. En este punto, es imperativo mantener la orientación correcta del colon con respecto al flujo lumínico (proximal = entrada, distal = salida). Repita los pasos 3.2-3.3 para los 6 pañuelos.
- Verifique que los bloqueos Luer de la aguja de entrada estén vacíos del medio. Si no es así, vacíelos. Agregue estimulaciones a la aguja de entrada Luer lock (para evitar la entrada de burbujas de aire en el lumen). Repita este paso para cada colon con la estimulación adecuada.
- Compruebe que todos los pañuelos estén conectados y coloque la tapa de la cubierta encima del dispositivo.
- Conexión del dispositivo de cultivo de órganos a las bombas
- Coloque el dispositivo en la cámara precalentada con control de temperatura (37 °C).
- Conecte el flujo de gas
- Conecte el adaptador de gas a la tapa de la cubierta con la aguja de entrada adecuada.
- Conecte los tubos de entrada y salida al dispositivo.
nota: Conecte el lado proximal del colon a las tinas de entrada.
- Purgue el lumen con las entradas de estimulación.
- Fluya suavemente la estimulación luminal a través del intestino y verifique el flujo del medio en los tubos de salida.
- Lave el medio externo.
- Lave el medio externo 3 veces (ajuste las bombas a una velocidad de 600 μL/min tanto para el pozo de entrada como para el de salida). Cada lavado dura 1 minuto (empezando por vaciar el pozo).
- Inicie el experimento.
- Arranque las bombas a las siguientes velocidades:
Caudal: lúmen: entrada- 30 μL/h, salida- 35 μL/h
Medio externo: entrada- 1000 μL/h, salida- 950 μL/h
nota: El tiempo del experimento puede variar entre 30 min y 24 h.
- Fin del experimento (hasta 24 h para cultivos de órganos de colon)
- Desconecte todos los tubos del dispositivo.
- Desconecte los pañuelos de las agujas y continúe con las lecturas deseadas.
