Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Preparación WS-CM
- Genere un medio acondicionado de humo completo (WS-CM) como se describió anteriormente.
- Prepare WS-CM haciendo pasar el humo de cuatro cigarrillos de referencia 3R4F a través del medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sin rojo de fenol utilizando el siguiente régimen de fumado: 35-60-2, volumen de inhalación en ml, intervalo de inhalación en segundos y duración de la inhalación en segundos, respectivamente. Cada preparación genera una muestra de 20 ml.
- Etiquete los tubos con la fecha, la hora de finalización y el nombre y número del cigarrillo. Almacene las alícuotas de 500 μl a -80 °C inmediatamente después de terminar de fumar.
- Analice las alícuotas de WS-CM congelado para determinar los niveles de nicotina, nitrosaminas específicas del tabaco e hidrocarburos aromáticos policíclicos como se describió anteriormente.
>2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica, PBMCs
- Recolectar sangre fresca de donantes sanos (que no son consumidores de productos de tabaco) Aísle las PBMC de la sangre fresca como se describe a continuación.
- Antes de la llegada de la bolsa de sangre, tenga a mano un frasco de 500 ml, unas tijeras, un tampón de aislamiento y la solución salina tamponada con fosfato (DPBS) (RT) de Dulbecco en una campana de cultivo celular de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). El tampón de aislamiento debe estar protegido de la luz.
- Sostenga la bolsa de sangre boca abajo y corte el tubo justo debajo de donde se ha sujetado, dejando al menos 3 cm de tubo.
- Retire la tapa de la botella de 500 ml y sostenga el tubo por encima de la abertura de la botella. Levante la bolsa de sangre e inviértala para permitir que la sangre fluya libremente de la bolsa a la botella hasta que la bolsa esté vacía. Permita que la sangre fluya hacia la pared interior de la botella en lugar de hacia abajo para evitar crear burbujas.
- Vierta el tampón de aislamiento en el frasco en una proporción de 1:5 entre el tampón de aislamiento y la sangre. Tape bien la botella e inviértala suavemente, de extremo a extremo, 10 veces. Deje el frasco en la campana de cultivo celular para incubar con las luces apagadas, durante 1 hora en RT.
- Se acumulará una capa clara de color pajizo sobre la sangre. Retirar esta capa con una pipeta serológica de 25 ml en tubos cónicos de 50 ml. La cantidad recolectada puede variar de 50 a 300 ml, dependiendo del sujeto que donó sangre.
- Centrifugar los tubos a 200 x g durante 10 min en RT.
- Aspire el sobrenadante translúcido, dejando la bolita de color sangre oscuro. El pellet estará suelto pero viscoso.
- Pipetear 3 ml de tampón de aislamiento en tubos cónicos de 15 ml.
- Al pellet resuspendido, agregue 20 ml de DPBS por cada 50 ml de líquido de color pajizo recolectado en el paso 2.1.5. Vórtice para mezclar bien y consolidar el líquido resuspendido de múltiples tubos. Este líquido contiene células sanguíneas en suspensión.
- Con una pipeta de transferencia, transfiera 5 ml de las células sanguíneas en suspensión a 3 ml de tampón de aislamiento en el paso 2.1.8. Incline el tubo cónico de 15 ml que contiene la suspensión celular lenta y suavemente para crear dos capas separadas. Centrifugar los tubos a 400 x g durante 40 min a RT con una aceleración mínima y sin freno.
- Utilice una pipeta de transferencia para eliminar la capa intermedia turbia resultante (capa leucocitaria) que contiene PBMC en un tubo cónico de 50 ml. Evite dibujar otras capas transparentes debajo de él. No transfiera más de 25 ml en cada tubo cónico de 50 ml.
- Agregue 25 ml de tampón de funcionamiento en frío (o más para llenar todo el volumen restante del tubo cónico de 50 ml) para lavar las células. Centrifugar las células a 400 x g durante 10 min a 4 °C.
- Vuelva a suspender el pellet con 10 ml de tampón de funcionamiento. Cuente las células y utilícelas inmediatamente o colóquelas en hielo para congelarlas.
>3. Congelación y descongelación de los PBMC
- Centrifugar las células mononucleares de la sangre eriférica (PBMC) que se recogieron en el paso 2.1.13 durante 10 min a 400 x g.
- Llene el recipiente de congelación con alcohol isopropílico según las instrucciones del fabricante.
cautela: El alcohol isopropílico es inflamable y extremadamente tóxico.
- Vuelva a suspender el pellet con medio RPMI 1640 (4 °C) que contiene un 20% de suero fetal bovino (FBS) y un 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Este es el medio de congelación RPMI 1640. Vuelva a suspender el pellet con una cantidad de medio de congelación que dará como resultado una suspensión de aproximadamente 5 x 107 celdas/ml. El número de celdas disponibles para congelar variará.
- Dispense 1 ml de alícuotas de suspensión celular en criotubos de 2 ml y coloque los criotubos en el recipiente de congelación. Coloque el recipiente de congelación con tubos criogénicos en un congelador a -80 °C para almacenar O/N y luego retire los tubos criogénicos y transfiéralos para almacenar en un congelador criogénico entre -150 °C y -190 °C.
- Retire el tubo criogénico del almacenamiento criogénico y descongélelo rápidamente con una agitación suave en un baño de agua a 37 °C.
- Transfiera inmediatamente las PBMC descongeladas en el tubo criogénico a un tubo cónico de 15 ml con 10 ml de medio completo RPMI 1640 (4 °C) que contenga 10% de FBS, 1% de Pen/Strep y 1% de L-glutamina. El contenido del criotubo descongelado debe transferirse lo antes posible para obtener la máxima viabilidad celular.
- Centrifugar las PBMC a 400 x g durante 10 min.
- Vuelva a suspender el pellet con 5 ml de medio completo RPMI 1640 y cuente las células.
- Mida la viabilidad celular mediante métodos establecidos, como el método de exclusión de azul de tripano. En general, la viabilidad celular con este método es de aproximadamente el 90 - 95%. Los PBMC ya están listos para su uso en experimentos.
>4. Tinción intracelular y citometría de flujo
NOTA: Las diluciones enumeradas aquí son para el propósito de este estudio. Las diluciones se pueden ajustar en consecuencia.
- Diluya WS-CM en una placa de 96 pocillos utilizando el medio completo RPMI hasta un volumen total de 100 μl/pocillo a la concentración de 0,3, 1,56, 3 y 5 μg/ml de unidades de equinicotina.
- En la misma placa, diluya la nicotina a las siguientes concentraciones: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 y 4000 μg/ml.
cautela: La nicotina es extremadamente tóxica y peligrosa para el medio ambiente.
- Añadir 100 μl de PBMCs suspendidas en medio completo RPMI a una concentración de 1 × 106 células/pocillo. El volumen total de células más WS-CM o nicotina será de 200 μl/pocillo.
- Cubra la placa e incube durante 3 horas a 37 °C y 5% de CO2.
- Lavar las células en RT centrifugando a 300 × g durante 3 min, aspirando el sobrenadante, vórtice la parte inferior de la placa con la placa cubierta y finalmente resuspendiendo las células con 200 μl de tampón de funcionamiento helado, y repetir el paso de lavado una vez más.
- Agregue 200 μl de medio completo RPMI a la placa y repita el paso de lavado una vez más.
- Prepare las concentraciones de trabajo de 2 μl/ml de GolgiPlug y 10 μg/ml de LPS utilizando el medio completo RPMI y añada 200 μl a cada pocillo.
- Incubar la placa durante 6 horas a 37 °C y 5% de CO2.
- Al final del paso 9.8, lavar las celdas con tampón de funcionamiento (4 °C) y centrifugar a 300 x g durante 3 min a 4 °C.
- Añadir 100 μl de Cytofix a cada pocillo e incubar durante 20 min a 4 °C.
- Lave las células 3 veces como se describe en el paso 9.9 con 1x Permwash (4 °C) a 300 x g durante 3 min a 4 °C.
- Agregue 45 μL de 1x Cytoperm a cada pocillo seguido de 5 μl de cada uno de los siguientes anticuerpos a cada pocillo: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubar a 4 °C durante 30 min.
- Lave las células dos veces como se describe en el paso 9.9 con 1x Permwash (4 °C) y una vez con tampón de funcionamiento (4 °C) a 300 x g durante 3 min a 4 °C.
- Vuelva a suspender las células con 200 μl de paraformaldehído al 2% (4 °C). Transfiera las células a tubos de 12 × 75 mm y analice las muestras en un citómetro de flujo.
cautela: El paraformaldehído es corrosivo, extremadamente tóxico y un peligro para la salud.
