Síntesis in vitro de biofilm por Staphylococcus aureus

1. Preparación de biofilm in vitro

1. Obtener colonias aisladas de S. aureus a partir de una cepa criopreservada utilizando una técnica de placa de rayas en una placa de agar rica en nutrientes, como el agar de soja tríptico (ver Tabla de Materiales).
2. Cubra los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos con 100 μL de poli-L-lisina (PLL) al 0,001% (v/v) diluido en H₂O estéril e incube a temperatura ambiente durante 30 min. Asépticamente, aspire la solución de PLL utilizando una trampa de aspiración asistida por vacío. Deje que los pozos se sequen durante la noche a temperatura ambiente.
   nota: Todos los pasos de aspiración del protocolo se realizan utilizando una trampa de aspiración asistida por vacío, a menos que se indique lo contrario.
3. Preparar un cultivo nocturno inoculando una colonia de S. aureus en medio esencial mínimo alfa (MEMα) suplementado con glucosa al 2% e incubar a 37 °C, agitando a 200 rpm durante 16-18 h.
4. Diluir el cultivo durante la noche transfiriendo 50 μL a 5 mL de MEMα fresco suplementado con glucosa al 2% e incubar a 37 °C, agitando a 200 rpm, hasta la fase logarítmica media, generalmente entre una densidad óptica de 600 (OD_{600 nm}) de 0,5-0,8. Utilice MEMα para normalizar el cultivo logarítmico medio a un diámetro exterior de_{600 nm} de 0,1.
5. Transfiera 150 μL de cultivo normalizado a cada pocillo de la placa de 96 pocillos tratada con PLL. Incubar estáticamente durante 18-20 h en una cámara humidificada a 37 °C.
   nota: Las biopelículas también se pueden cultivar en otros formatos, como portaobjetos de μ canales (ver Tabla de Materiales).
6. Aspirar el sobrenadante para eliminar las células planctónicas. Lave suavemente la biomasa restante con 150 μL de solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks para eliminar las células sueltas. Agregue HBSS gota a gota para evitar alterar la biopelícula.
   nota: Mientras aspira el sobrenadante y el HBSS durante los lavados, deje solo suficiente líquido (sobrenadante o HBSS) en los pocillos que contienen biopelícula para que la biopelícula aún esté sumergida. Esto evita la interrupción de la estructura de la biopelícula cuando se agrega HBSS gota a gota para lavar la biopelícula.
7. Repita el paso 1.6 al menos dos veces más para eliminar todas las células planctónicas. En este punto, las biopelículas están listas para experimentos posteriores inmediatos.
   nota: Si las biopelículas no se utilizan para experimentos con neutrófilos, el HBSS puede sustituirse por solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se prefiere el HBSS al PBS, ya que el HBSS contiene componentes, incluida la glucosa, que proporcionan las condiciones óptimas para la activación de los neutrófilos.