1. Preparación antigénica
>NOTA: Se pueden utilizar tres preparaciones antigénicas diferentes para evaluar la respuesta inmunitaria al Hi. Estos son: 1) un componente subcelular (típicamente de la pared celular bacteriana); 2) bacterias muertas e inactivadas; y 3) bacterias vivas. Determinar el uso de cada preparación antigénica antes del inicio de cualquier experimento.
- Componentes subcelulares
- Obtener componentes subcelulares de fuentes, incluyendo preparaciones comerciales, componentes desarrollados internamente y/o de otros investigadores.
nota: Se pueden utilizar componentes subcelulares, generalmente de la pared celular bacteriana, e incluyen proteínas de la membrana externa como P6 y lipooligosacárido (LOS). Estos componentes subcelulares generalmente se derivan en centros especializados. La descripción de cómo se hacen está más allá del alcance de este artículo. Se recomienda el contacto directo con expertos en este campo para obtener estos componentes.
- Bacterias muertas/inactivadas
- Obtenga la bacteria de la muestra apropiada (por ejemplo, esputo o broncoscopia). Confirmar que la cepa es H. influenzae utilizando un laboratorio de microbiología apropiado. Realizar la tipificación de las muestras de H. influenzae para confirmar que no son tipificables (NTHi, por un laboratorio de microbiología especializado).
- Para obtener un antígeno representativo, use varias cepas de NTHi (al menos 5, cada una de aproximadamente la misma cantidad) para producir un antígeno combinado. Almacene las cepas a -70 °C en caldo de glicerol en tubos de microcentrífuga.
nota: En este experimento, se utilizaron diez cepas distintas.
- Descongele las cepas (un tubo de microcentrífuga a la vez) en placas de agar chocolate y crezca durante la noche en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2. Añadir las bacterias a 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y lavarlas dos veces (centrifugar a 300 x g durante 5 min). Utilice un estándar de MacFarland o un espectrofotómetro para alícuota de NTHi a una concentración de 10a 8 mL (utilizando un recipiente de 5 mL o equivalente).
- El calor inactiva las bacterias colocándolas en un baño de agua a una temperatura de 56 °C durante 10 min.
- Sonicar las bacterias utilizando un ajuste de sonicación continua a una velocidad de rango bajo a medio durante 30 segundos.
- Alícuota el volumen apropiado de muestras en tubos de microcentrífuga. Para una muestra de 10a 8 mL, use alícuotas de 50 μL (es decir, 20 muestras por mL) y congélelas a -70 °C hasta que sea necesario.
- Bacterias vivas
- En primer lugar, caracterice las bacterias vivas como se menciona en el paso 1.2.1. Usa una cepa bien caracterizada. Asegúrese de que la cepa también se almacene en caldo de glicerol a -70 °C como reserva.
- Cultive las bacterias en medios enriquecidos como placas de agar chocolate o en caldo.
- Para usar placas de agar chocolate, esparca las bacterias durante un mínimo de cada 3-4 días con esparcidores estériles.
- Alternativamente, use el caldo Brain Heart Infusion (BHI) enriquecido con factores X (hemina) y V (dinucleótido de adenina β-nicotinamida) para cultivar las bacterias. Inocular NTHi a partir de placas nocturnas en 5-10 mL de caldo BHI suplementado con hemina y dinucleótido de adenina β-nicotinamida (ambos 10 μg/mL) y cultivo durante la noche a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%
nota: Esto tiene la ventaja de la reproducibilidad, un mayor número de unidades formadoras de colonias (UFC) y de que todas las bacterias se encuentran en una fase similar de crecimiento logarítmico (en placas, la viabilidad bacteriana puede ser mayor dependiendo de la posición en el cultivo).
- Utilice una multiplicidad de infección (MOI) de 100 bacterias en una célula para provocar una fuerte respuesta inmunitaria mientras se mantiene la viabilidad celular. Utilice el estándar de MacFarland o el espectrofotómetro para evaluar el número de bacterias.
- Asegúrese de que los medios utilizados para los ensayos de NTHi en vivo estén libres de suero humano, ya que esto matará las bacterias. Las muestras de suero animal (por ejemplo, suero fetal de ternero) generalmente no causan ningún problema.
nota: Utilice los métodos que se describen a continuación para analizar muestras de tejido estándar, como sangre periférica, muestras de broncoscopia (en particular, lavado broncoalveolar [BAL]) y tejido pulmonar resecado. Incubar las muestras con antígeno Hi desde 10 min hasta 24 h o más.
>2. Evaluación de la función linfocitaria en sangre periférica
- Utilice preparaciones de sangre entera o de células mononucleares para los ensayos de citometría de flujo.
- Adquisición de muestras de cada sujeto por venopunción. Recolectar 4 mL de sangre de una vena periférica en un tubo de heparina de litio y dividir las muestras en alícuotas para el control y la estimulación del antígeno.
- Añadir anticuerpos coestimuladores (anti-CD28 y CD49d, 1 μL/mL) a ambas muestras. Añadir NTHi a la muestra de antígeno e incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 1 h. Para la preparación de NTHi muerta, agregue 200 μL del antígeno a 2 mL de sangre. En el caso de los NTHi vivos, agregue células NTHi vivas a un MOI de 100:1 a los glóbulos blancos (medidos por el hemocitómetro).
- Añadir el agente bloqueante de Golgi Brefeldina A (10 μL/mL) a las muestras e incubarlas durante otras 5 h.
nota: El bloqueo del aparato de Golgi impide que las citocinas se exporten fuera de la célula.
- Si se utiliza sangre entera, lisar los eritrocitos con cloruro de amonio al 0,8% para dejar solo los leucocitos en solución. Fijar los leucocitos con 500 μL de paraformaldehído al 1%-2% durante 1 h.
- Contar las células con hemocitómetro, permeabilizar 10a 6 células con 100 μL de saponina al 0,1% durante 15 minutos e incubar las células con anticuerpos marcados con fluorescente. Lave las células y analícelas con un citómetro de flujo.
nota: La cantidad de anticuerpos marcados con fluorescencia será específica para cada citocina. Siga las instrucciones del fabricante. Normalmente, se tiñen de 10a 6 células en 100 μL de solución durante 1 h. La mayoría de los anticuerpos obtenidos comercialmente serán suficientes para realizar entre 25 y 100 pruebas.
- Determine la proporción de células que responden al antígeno mediante la activación de la población de linfocitos relevante (las células se activan mediante CD45, luego mediante CD3 y más tarde mediante la expresión de CD4 o CD8) como se muestra en la Figura 1. Realice la tinción de fondo en células no estimuladas para todas las citocinas que se van a analizar. Examinó 100.000 células para analizar cada citocina tanto en busca de células estimuladas como de control.
