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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Preparación antigénica
- Bacterias vivas
- En primer lugar, caracterizar las bacterias vivas. Obtenga la bacteria de la muestra apropiada (por ejemplo, esputo o broncoscopia). Confirmar que la cepa es Haemophilus influenzae utilizando un laboratorio de microbiología adecuado. Realizar la tipificación de las muestras de H. influenzae para confirmar que no se pueden tipificar (por un laboratorio especializado en microbiología). Usa una cepa bien caracterizada. Asegúrese de que la cepa también se almacene en caldo de glicerol a -70 °C como reserva.
- Cultive las bacterias en medios enriquecidos como placas de agar chocolate o en caldo.
- Para usar placas de agar chocolate, esparca las bacterias durante un mínimo de cada 3-4 días con esparcidores estériles.
- Alternativamente, use el caldo Brain Heart Infusion (BHI) enriquecido con factores X (hemina) y V (dinucleótido de adenina β-nicotinamida) para cultivar las bacterias. Inocular H. influenzae (NTHi) no tipificable a partir de placas durante la noche en 5-10 mL de caldo BHI suplementado con hemina y dinucleótido de adenina β-nicotinamida (ambos 10 μg/mL) y cultivo durante la noche a 37 °C en una incubadora de dióxido de carbono al 5% y CO2.
nota: Esto tiene la ventaja de la reproducibilidad, un mayor número de unidades formadoras de colonias (UFC) y de que todas las bacterias se encuentran en una fase similar de crecimiento logarítmico (en placas, la viabilidad bacteriana puede ser mayor dependiendo de la posición en el cultivo).
- Utilice una multiplicidad de infección (MOI) de 100 bacterias en una célula para provocar una fuerte respuesta inmunitaria mientras se mantiene la viabilidad celular. Utilice el estándar de MacFarland o el espectrofotómetro para evaluar el número de bacterias.
- Asegúrese de que los medios utilizados para los ensayos de NTHi en vivo estén libres de suero humano, ya que esto matará las bacterias. Las muestras de suero animal (por ejemplo, suero fetal de ternero) generalmente no causan ningún problema.
NOTA: Utilice los métodos que se describen a continuación para analizar muestras de tejido estándar, como sangre periférica, muestras de broncoscopia (en particular, lavado broncoalveolar [BAL]) y tejido pulmonar resecado. Incubar las muestras con antígeno Hi desde 10 min hasta 24 h o más.
>2. Evaluación de la función linfocitaria/mediadores inflamatorios en el tejido pulmonar
- Por lo general, no es posible obtener suficientes linfocitos de la broncoscopia; por lo tanto, utilice el tejido pulmonar de las muestras de lobectomía. La optimización de las muestras de tejido pulmonar requiere una estrecha colaboración con el servicio de anatomía patológica. Asegúrese de que el tejido tenga un margen de al menos 3 cm del tumor y que sea el tejido celular sin enfisema significativo (según lo determine el patólogo).
- Romper el tejido pulmonar en una suspensión celular antes de que pueda usarse para ensayos de citometría de flujo. Digiere el tejido pulmonar químicamente (por ejemplo, con colagenasa) o lo disgrega mecánicamente.
nota: Se puede preferir la desagregación mecánica del tejido, ya que se asocia con una mejor tinción de la superficie de las células (p. ej., marcaje de CD3/4).
- Obtener muestras de lobectomía de un patólogo (generalmente obtenidas de pacientes que se someten a tratamiento para el cáncer de pulmón). Cortar unos 20-40 g de la muestra en3-5 mm 3 secciones. Colóquelos dentro de una cámara estéril de 50 μL antes de fragmentarlos mecánicamente con un desagregador adecuado.
- Después de la desagregación tisular, lisar los eritrocitos con una solución 10:1 (es decir, 5 mL) de cloruro de amonio al 0,8% (150 mM de cloruro de amonio (NH4Cl), 1 mM de bicarbonato de sodio (NaHCO3) y solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a 0,1 mM.
nota: Alternativamente, se puede utilizar un sistema automatizado como Q-prep.
- Vuelva a suspender las células en RPMI estéril (el volumen dependerá del número de células y generalmente es de 10-20 mL) y luego filtre a través de una malla de nailon estéril de 100 μm. Cuente el número de células viables utilizando el método de exclusión de azul de tripano.
>3. Ensayo de infección NTHi
- Resuspender las células pulmonares hasta una concentración final de 4 x 106 células/mL por tubo (muestras de control y estimuladas).
- Utilice una suspensión de 4 x 106-6 x 106 celdas en 1 mL de RPMI para el tubo de control (negativo). Utilice la misma cantidad para el tubo NTHi (cualquier muestra adicional puede utilizarse como control positivo con el superantígeno estafilocócico E (SEB). Infecta las células en el tubo NTHi a un MOI de 100 bacterias por célula. Afloje la tapa media rotación para permitir la transferencia de gas en los tubos.
- Coloque las células en un rotador de tubos e incube a 37 °C mientras gira a 12 rpm.
- Para evitar la exportación extracelular de citoquinas, añadir un bloqueador de Golgi (Brefeldina A) a las suspensiones celulares 1 h después de la estimulación hasta una concentración final de 10 μg/mL. Regrese las suspensiones celulares para una incubación adicional de 16 a 22 h en rotación.
- Lavar la suspensión celular con 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene un 1% de albúmina sérica bovina (BSA) y un 0,01% de azida sódica, NaN3.
- Agregue los anticuerpos para la tinción de citocinas intracelulares (la elección de los anticuerpos debe ser determinada por el investigador). Tiñir la suspensión celular para marcadores específicos de la superficie celular de linfocitos humanos (por ejemplo, CD45, CD3, etc.) durante 1 h. Lavar las células con PBS, fijarlas y permeabilizarlas.
- Fije las celdas con 500 μL de paraformaldehído al 1%-2% durante 1 h.
- Contar las células con hemocitómetro, permeabilizar 10a 6 células con 100 μL de saponina al 0,1% durante 15 minutos e incubar las células con anticuerpos marcados con fluorescente. Lave las células y analícelas con un citómetro de flujo.
nota: La cantidad de anticuerpos marcados con fluorescencia será específica para cada citocina. Siga las instrucciones del fabricante. Normalmente, se tiñen de 10a 6 células en 100 μL de solución durante 1 h. La mayoría de los anticuerpos obtenidos comercialmente serán suficientes para realizar entre 25 y 100 pruebas.
- Incubar las células con anticuerpos de tinción de citocinas intracelulares (por ejemplo, interferón gamma, IFN-γ y factor de necrosis tumoral beta, TNF-α o interleucina, IL-13 e IL-17A) durante 1 h.
nota: Se recomienda teñir primero los marcadores de superficie y luego los intracelulares, ya que la fijación puede causar cambios conformacionales en las proteínas de superficie a las que se unen los anticuerpos.
- Lave las células con 500 μL de PBS y vuelva a suspender 100 μL de PBS antes de la adquisición de datos en un citómetro de flujo.