Determinación de la producción de ROS por neutrófilos tras la interacción con biofilm opsonizado

Resumen

Fuente: Rana, P. S. J. B., et al. Ensayos in vitro estandarizados para visualizar y cuantificar las interacciones entre neutrófilos humanos y las biopelículas de Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2022)

En este video, demostramos un ensayo de quimioluminiscencia in vitro para detectar la generación de especies reactivas de oxígeno por parte de los neutrófilos al exponerse a una biopelícula bacteriana opsonizada.

Protocolo

1. Medición de ROS producidas por neutrófilos

1. Añadir 100 μL de suero humano normal al 20% (diluido en HBSS) gota a gota al biofilm lavado e incubar a 37 °C en condiciones estáticas durante 30 min para opsonizar el biofilm.
2. Aspirar la solución de suero al 20% y lavar las biopelículas gota a gota con 150 μL de HBSS una vez. Aspirar el HBSS, dejando atrás los pozos con biopelículas opsonizadas.
   nota: Para la interpretación del experimento, se recomienda un mínimo de cuatro grupos: (A) Neutrófilos + Biopelícula, (B) Neutrófilos + PMA (control positivo, ver Tabla de Materiales), (C) Solo Neutró....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de centrífuga cónicos de 50 mL	Termo Científico	339652
Hisopo con alcohol	Bd		Se utiliza para la extracción de sangre
Contador de células	Suministro de Bal	202C
Placas de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos con fondo transparente	Coprotagonista	3370
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco 1x	Gibco	14190-144
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	Sin calcio, magnesio y rojo fenol
Hemotómetro	Línea brillante
Luminol	sigma	A8511-5G
Medios esenciales mínimos (MEM) Alpha 1x	Gibco	41061-029
Suero humano normal	Tecnología de complemento	Nhs
Placa de Petri (100 x 15 mm)	VWR	25384-342
Forbol 12-miristato 13-acetato
Solución de poli-L-lisina	sigma	P4707-50ML
Software SoftMax Pro	Dispositivos moleculares		Software de lectura de microplacas utilizado para la adquisición de datos
SpectraMax i3x	Dispositivos moleculares		Lector de microplacas