Determinación de la producción de ROS por neutrófilos tras la interacción con biofilm opsonizado

Resumen

Fuente: Rana, P. S. J. B., et al. Ensayos in vitro estandarizados para visualizar y cuantificar las interacciones entre neutrófilos humanos y las biopelículas de Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2022)

En este video, demostramos un ensayo de quimioluminiscencia in vitro para detectar la generación de especies reactivas de oxígeno por parte de los neutrófilos al exponerse a una biopelícula bacteriana opsonizada.

Protocolo

1. Medición de ROS producidas por neutrófilos

1. Añadir 100 μL de suero humano normal al 20% (diluido en HBSS) gota a gota al biofilm lavado e incubar a 37 °C en condiciones estáticas durante 30 min para opsonizar el biofilm.
2. Aspirar la solución de suero al 20% y lavar las biopelículas gota a gota con 150 μL de HBSS una vez. Aspirar el HBSS, dejando atrás los pozos con biopelículas opsonizadas.
   nota: Para la interpretación del experimento, se recomienda un mínimo de cuatro grupos: (A) Neutrófilos + Biopelícula, (B) Neutrófilos + PMA (control positivo, ver Tabla de Materiales), (C) Solo Neutrófilos y (D) Biopelícula solamente.
3. Añadir luminol (ver Tabla de Materiales) a los neutrófilos resuspendidos en HBSS a una concentración de 4 x 10⁶ células/mL tal que la concentración final de luminol sea de 50 μM. Esta solución está lista para usar para los grupos (A) y (C). Añadir 4 x 10⁵ neutrófilos mezclados con luminol a los pocillos con biofilms opsonizados.
4. En un tubo aparte, prepare 50 μM de solución de luminol en HBSS sin neutrófilos y añádala al pocillo que contiene biopelícula (grupo D).
5. Alícuota 350 μL de neutrófilos mezclados con luminol y añadir forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a una concentración final de 500 ng/mL a la mezcla. Para el grupo (B), agregue 4 x 10⁵ neutrófilos de esta mezcla en pocillos sin biopelícula. Esto sirve como un control positivo.
   nota: La concentración de PMA indicada en este paso es relativamente alta para garantizar una respuesta de ráfaga robusta, ya que los neutrófilos estimulados por PMA son un control positivo. El PMA se puede utilizar a una concentración más baja para activar los neutrófilos, dependiendo del experimento.
6. Centrifugar la placa a 270 x g durante 30 s a 4 °C.
7. Asegúrese de que el lector de placas esté ajustado a 37 °C junto con el ajuste de luminiscencia y lectura cinética durante 60 minutos con intervalos de 3 minutos. Coloque la placa en el lector de placas para medir la producción de ROS por neutrófilos durante 60 min.
   nota: Para este ensayo, las biopelículas se cultivaron en placas blancas utilizadas para los ensayos de luminiscencia. El PMA es un agonista conocido para la respuesta de estallido oxidativo. Al realizar estudios que involucren PMA, asegúrese de que se agregue PMA en el paso final mientras la solución que contiene neutrófilos está fría, ya que PMA inicia inmediatamente la respuesta de ráfaga.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de centrífuga cónicos de 50 mL	Termo Científico	339652
Hisopo con alcohol	Bd		Se utiliza para la extracción de sangre
Contador de células	Suministro de Bal	202C
Placas de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos con fondo transparente	Coprotagonista	3370
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco 1x	Gibco	14190-144
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	Sin calcio, magnesio y rojo fenol
Hemotómetro	Línea brillante
Luminol	sigma	A8511-5G
Medios esenciales mínimos (MEM) Alpha 1x	Gibco	41061-029
Suero humano normal	Tecnología de complemento	Nhs
Placa de Petri (100 x 15 mm)	VWR	25384-342
Forbol 12-miristato 13-acetato
Solución de poli-L-lisina	sigma	P4707-50ML
Software SoftMax Pro	Dispositivos moleculares		Software de lectura de microplacas utilizado para la adquisición de datos
SpectraMax i3x	Dispositivos moleculares		Lector de microplacas